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今天跟大家分享的是最近發表在Molecular Therapy-Oncolytics上的一篇文章，影響因子7.2。

Single-cell RNA-sequencing analyses identify heterogeneity of CD8 ⁺ T cell subpopulations and novel therapy targets in melanoma

單細胞 RNA 測序分析確定了黑色素瘤中 CD8⁺T 細胞亞群的異質性和新的治療靶點

小仙女 doi: 10.1016/j.omto.2020.12.003 Molecular Therapy-Oncolytics（IF=7.2）2021/7/4

首先讓我們通過摘要了解下這篇文章的主要內容，CD8⁺ T 細胞在抗腫瘤免疫中發揮著重要的作用，它們的高浸潤性與良好預后相關。然而，腫瘤微環境中的CD8+T細胞亞群可能在預后、進展和免疫治療中發揮不同的作用。在這篇文章中，作者分析了先前發表的單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 黑色素瘤數據來探索 CD8 ⁺ T 細胞亞群的異質性，確定了 7 個主要亞群并描述了不同亞群中免疫檢查點的動態轉錄圖譜，最后確定了不僅免疫抑制檢查點的基因而且 PMEL、TYRP1 和 EDNRB 都可以作為黑色素瘤治療的潛在靶點。

一． 材料和方法

1.1 scRNA-seq 和 RNA-seq 數據

scRNA-seq數據(Smart-seq data, GEO: GSE120575 and 10x Genomics data, GEO: GSE139829)，T細胞的scRNA-seq數據(Smart-seq data, GEO: GSE72056)，從 TCGA 和 GTEx 數據庫下載了 471 個皮膚黑色素瘤和 1,809 個正常樣本的 RNA-seq 數據。

1.2 細胞亞群識別

作者使用了 48 個 smart-seq 和 11 個 10x Genomics 黑色素瘤樣本來進行 CD8 ⁺ T 細胞分析。使用Seurat 包進行標準化處理，應用 PCA 和 Find Clusters來識別細胞簇。作者分別從 Smart-seq 和 10x Genomics 中分離了 3,525 和 7,336 個 CD8 ⁺ T 細胞，應用Harmony 算法整合了這兩個平臺的總共 10,861 個 CD8 ⁺ T 細胞。最后識別了7 個 CD8 ⁺ T 細胞亞群并根據先前報道的標記基因注釋了幼稚/記憶 CD8 ⁺ T 細胞，細胞毒性 CD8 ⁺ T 細胞和耗竭的CD8 ⁺ T細胞。

1.3 Bulk RNA-seq 中 CD8 ⁺ T 細胞亞群的細胞成分

應用CIBERSORT算法來識別Bulk RNA-seq數據中CD8 ⁺ T 細胞亞群的細胞成分。作者將 TCGA 腫瘤樣本分為兩個亞組：高比例 CD8 ⁺ T 細胞亞群和低比例 CD8 ⁺ T 細胞亞群來探討CD8 ⁺ T 細胞亞群與黑色素瘤患者預后之間的關系。作者還根據TCGA的信息將腫瘤樣本分為四個病理階段并在不同病理階段鑒定CD8 ⁺ T細胞亞群的動態變化。此外，作者應用 ggstatsplot包分析了正常和腫瘤樣本之間浸潤細胞亞群的差異比例。

1.4 通路活性分析

在這一部分，作者進行了 GO 分析、KEGG 分析和 GSEA分析，以闡明單細胞水平不同臨床結果的機制。作者對亞群的通路活性進行了評分，進行缺氧與其他通路之間的Pearson相關分析，以確定缺氧的影響。

1.5 偽時間軌跡、細胞間相互作用和單細胞調控網絡分析

作者應用slingshot包對所有CD8 ⁺ T 細胞亞群進行軌跡分析，將初始/記憶亞群設置為起始亞群。隨后作者分析了幼稚/記憶亞群分化為疲憊亞群的過程中細胞毒性和檢查點分子的表達水平。應用CellphoneDB研究細胞與細胞的相互作用。此外，使用SCIENIC包計算細胞亞群的基因調控網絡。

1.6 新靶點分析

在這一部分，作者應用 Kaplan-Meier 生存分析來分析耗竭 CD8 ⁺ T 細胞亞群 2 中過表達的基因并通過ggstatsplot 包來驗證篩選靶標的表達水平。隨后，作者從FIREBROWSE 數據庫中分離了2,043 個 T 細胞來驗證新靶標。

二. 結果展示

2.1 識別黑色素瘤中的 CD8 ⁺ T 細胞亞群

作者首先基于所有基因表達水平的 t 分布隨機鄰域嵌入 (t-SNE) 分別在 smart-seq 和 10x Genomics 數據中識別亞群（圖1）。在 smart-seq 數據中識別出 12 個簇，而 10x Genomics 數據中識別出25個簇。然后，通過可視化 CD8 ⁺ T 細胞特征來識別特定細胞簇的不同表達程度。對于smart-seq數據，CD8A 和CD8B 主要在簇0中高表達。然而，10x Genomics 數據對cluster6、cluster8、cluster12、cluster 16 和 cluster 17具有特異性。隨后，作者將這些 CD8⁺T 細胞簇通過 Seurat 包的內置算法從兩個平臺中分離出來，并使用 Harmony 算法進行整合，分離出 10,861 個 CD8 ⁺ T 細胞進行后續的分析。將這些 CD8 ⁺ T 細胞聚集成 7 個亞群并使用先前報道的細胞標記進行注釋。最終，確定了四個細胞毒性亞群、兩個耗竭的亞群和一個幼稚/記憶亞群。每個亞群中的細胞比例顯示，細胞毒性亞群 4、幼稚/記憶亞群、耗竭亞群 2 和細胞毒性亞群3是黑色素瘤 TME 中最常見的細胞亞群。

2.2 CD8 ⁺ T 細胞亞群與預后相關

在這一部分，作者從scRNA-seq數據中提取特征基因，并利用這些矩陣對471例SKCM和1809例正常RNA-seq樣本進行去卷積得到SKCM和正常樣本中CD8 ⁺ T細胞亞群細胞成分（圖2）。SKCM 樣本包含幼稚/記憶、細胞毒性亞群 2、細胞毒性亞群 3、耗竭的亞群 1 和耗竭的亞群 2這幾種細胞亞群并且耗竭的亞群 2 占 CD8 ⁺ T 細胞的最大比例。接下來，作者進行了 Kaplan-Meier 生存分析來表征這些亞群的預后作用。作者發現高比例的幼稚/記憶和細胞毒性亞群 3 與良好的預后相關而耗竭的亞群2可能導致不良的預后。然后，作者探索了細胞毒性亞群 3 和耗竭亞群 2 在不同病理階段的動態變化。結果表明細胞毒性亞群 3 的比例隨著腫瘤進展而減少。相比之下，耗竭的亞群2的比例隨著腫瘤進展而增加，II 期比例最高。

2.3 異質通路活性的景觀

為了探索通路是否在不同的 CD8 ⁺ T 細胞亞群中存在異質性，作者進行了GO分析、 KEGG分析、GSEA和通路活性分析（圖3）。GO 分析顯示，耗竭的亞群 2 具有獨特的生物學過程，并且在該亞群中富集的生物學過程很少。幼稚/記憶和細胞毒性亞群 3 具有相似的生物學過程。然而，KEGG 分析結果顯示了每個 CD8 ⁺ T 細胞中相當大的異質性。然后作者使用代謝基因集對所有細胞亞群進行評分發現耗竭的亞群 1 具有最顯著的代謝通路活性。組氨酸代謝和酪氨酸代謝在耗竭的亞群 2 中顯著上調，耗竭的亞群1具有最高的通路活性。GSEA 分析結果顯示，氧化磷酸化和糖酵解/糖異生在耗竭的亞群 1 中顯示出高度上調的活性，與通路活性分析一致。在細胞毒性亞群 3 中觀察到氧化磷酸化和 TCA 循環的上調。

為了進一步表征不同亞群的異質性，作者還采用了標志基因集、PD-1 和 CTLA-4 信號通路來進行通路活性和 GSEA 分析。與上述代謝分析類似，幾乎所有標志性通路在耗竭的亞群 1 中普遍上調（圖 4）。作者還發現免疫檢查點通路、PD-1 和 CTLA-4 信號通路在每個細胞亞群中都被上調。重要的是，免疫檢查點通路的最高活性主要集中在細胞毒性亞群 2、細胞毒性亞群 3、耗竭的亞群 1 和耗竭的亞群 2。這些結果表明，阻斷免疫檢查點可能有助于促進 CD8 ⁺ T 細胞的抗腫瘤免疫反應。

2.4 偽時間軌跡揭示免疫檢查點的動態變化

在這一部分，作者進行了偽時間軌跡來探索 CD8 ⁺ T 細胞的分化程序是否會影響預后。作者在 CD8 ⁺ T 細胞分化過程中發現以下軌跡：幼稚/記憶 CD8 ⁺ T 細胞傾向于轉化為衰竭亞群 2（譜系 1）或細胞毒性亞群 1（譜系 2）（圖 5）。在譜系 1 程序中，細胞毒性特征將在幼稚/記憶 CD8 ⁺ T 細胞分化為細胞毒性亞群 3 的過程中上調，然后這些特征趨于下調，直到在耗竭的亞群2中表達量最低。在免疫檢查點（PDCD1、TIM-3/HAVCR2和LAG3）和共刺激分子（CD27）中觀察到類似的趨勢。然而，耗竭特征（CTLA4、TIGIT和TNFRSF9）和協同檢查點CD7呈上升趨勢。這些結果表明了黑色素瘤中CD8⁺T細胞的偽時間軌跡和免疫檢查點的時間依賴性變化。

2.5 CD8 ⁺ T 細胞亞群中的異質相互作用對和轉錄因子

由于不同CD8⁺T細胞亞群的異質性，作者分析了它們的通訊網絡，以確定主導相互作用的關鍵配體-受體對和細胞亞群。結果顯示耗竭的 CD8 ⁺ T 細胞亞群 1 在相互作用對中起主導作用（圖 6）。在不同的 CD8 ⁺ T 細胞亞群中，有 83 個重要的配體-受體對。其中，最常見的 5 個配體-受體對是 CCL5_CCR5、CD74_MIF、CD74_COPA、CCL4_CCR5 和 HLA_E_KLRK1。先前報道的一項研究已經確定轉錄因子 (TF) 可以塑造 T 細胞表型并調節基因表達。因此作者采用 SCENIC 來探索 CD8 ⁺ T 細胞亞群中潛在的差異化 TF。結果顯示TF 在特定亞群中表達，例如 KLF6、FOS、FOSB、JUNB 和 CREM 在幼稚/記憶亞群中的高表達。總的來說，這些分析確定了耗竭的 CD8 ⁺ T 細胞亞群 1為主要亞群、頻繁的配體-受體對以及 CD8 ⁺ T 細胞亞群的 TF 的差異調節。

2.6 PMEL、TYRP1 和 EDNRB 是新的治療靶點

由于高比例的衰竭亞群2導致SKCM預后不良，作者分析了該亞群中高表達的基因，以篩選出潛在的治療靶點（圖7）。通過 Kaplan-Meier 生存分析以篩選出 PMEL、TYRP1 和 EDNRB可能為新靶點，這些基因的高表達與 SKCM 的不良預后顯著相關。此外，這三個基因在 SKCM 的Bulk RNA-seq 樣本中也顯示出高表達。作者還探討了PMEL、TYRP1 和 EDNRB 是否會在不同的病理階段動態表達，發現只有TYRP1可能參與SKCM進展。接下來，作者通過 FIREBROWSE 數據庫研究了不同腫瘤中新靶點的轉錄水平。這些新靶點在SKCM和UVM中變異最顯著，這說明了新靶點與黑色素瘤的聯系緊密。總之，該部分結果表明與黑色素瘤密切相關的 PMEL、TYRP1 和 EDNRB 會導致不良的臨床結果，并可能作為新的治療靶點。

好啦~這篇文章的內容就這么多啦~總之，本研究基于黑色素瘤 scRNA-seq 數據表征了不同 CD8⁺T 細胞亞群之間的異質性。這些分析使我們能夠了解黑色素瘤 TME 中不同 CD8 ⁺ T 細胞亞群的異質功能。最重要的是，本研究確定了 PMEL、TYRP1 和 EDNRB 可以作為黑色素瘤的潛在治療靶點。