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給大家分享一篇剛剛發表在Cell Discovery（IF：38.079）上的文章。作者根據人類和小鼠HCC腫瘤的單細胞RNA測序顯示CAF的異質性。這項工作闡明了特定CAF亞群功能在理解腫瘤微環境和免疫系統之間相互作用的重要性。
肝細胞癌(HCC)是一種具有高度細胞異質性的免疫治療耐藥惡性腫瘤。細胞類型的多樣性以及腫瘤細胞與非腫瘤細胞之間的相互作用仍有待闡明。80%以上的HCC病例以成纖維細胞的激活、增殖和積累引起的廣泛肝纖維化為特征。HCC的腫瘤微環境（TME）的一個顯著特征是大量的癌癥相關成纖維細胞（CAFs），它可以分泌多種細胞因子、趨化因子和生長因子，直接或間接地支持癌細胞。這些CAF衍生因子對癌細胞來說不僅是直接的生存信號，也通過抑制免疫效應細胞的活性和招募免疫抑制細胞來改變免疫細胞環境，使癌細胞能夠逃避免疫監視。在HCC中，基質異質性，特別是CAFs，以及惡性細胞和基質細胞在單細胞分辨率下的相互作用仍然知之甚少。盡管先前的研究報道了CAFs通過各種機制調節肝癌的進展，而不管腫瘤中的CAF亞型如何，目前尚不清楚HCC中是否存在不同的CAF亞群的原機制，而且CAFs與TME中其他成分之間的復雜串擾仍不清楚，特別是對于不同CAF亞型。
來自未治療的HBV相關HCC（與乙型肝炎病毒有關的肝癌）患者的7個腫瘤和其中4個患者的相鄰肝組織的90572個細胞(圖1a，b)。使用已知的標記基因可以將細胞劃分為9種不同的細胞類型。值得注意的是，上皮細胞和腫瘤細胞以及包括MDSCs、T細胞、DC和CAFs在內的其他細胞具有高度的患者特異性，這表明HCC樣本之間存在顯著的分子瘤間異質性。
80%以上的HCC病例以成纖維細胞活化和聚集引起的廣泛肝纖維化為特征(圖1d)。每個亞簇顯示出不同的轉錄組特征(圖1e-g)。
接下來，作者進行了更深入的CAF表征，將研究擴展到小鼠HCC模型(圖2a，b)。HCC腫瘤中成纖維細胞的比例與人類HCC樣本中相似。除膽管細胞外，所有小鼠HCC腫瘤中存在所有類型的細胞。
從7個小鼠肝癌腫瘤的CAFs聚類為7個亞群，每個子簇顯示出不同的轉錄組特征(圖2c-e)。人類HCC腫瘤中發現的所有5種CAF亞型在小鼠HCC組織中也有表達(圖2c)。CD36+CAFs和lpCAFs富集了上調通路，包括ROS通路和膽固醇代謝(圖2f)。
mIF檢測發現CD36+ CAFs在人類和小鼠HCC腫瘤的腫瘤核心區域比腫瘤周圍區域更富集。此外，BCLC-B中lpmCAFs和lpCAFs的豐度比在BCLC-A期HCC中更豐富。使用熒光激活細胞分選(FACS)分離人類相鄰肝組織中的成纖維細胞，發現這些細胞可以聚集成相同的5種CAF亞型。CD36+ CAFs在HCC腫瘤中特異性富集(圖3a，b)，而vCAFs在腫瘤中的數量略高于鄰近肝組織(圖3b，c)，這些結果在獨立數據集中得到了驗證（圖3d，e)。
偽時序分析表明狀態轉換軌跡包含兩個譜系，呈現出從祖細胞狀態到終端效應狀態的分叉結構(圖3f，g)。兩個譜系都從“祖細胞”狀態開始，在中間狀態之后發散。觀察到以CAF轉分化為特征的mCAFs位于祖細胞狀態，lpmCAFs(CD36+ CAFs)處于中間狀態，最終分化為vCAFs、lpCAFs和apCAFs，向最終效應狀態動態過渡。
之后，作者進行了細胞間相互作用分析。在9種細胞組中檢測到71對顯著配體受體對，并將其進一步分為25條信號通路(圖4a）。MIFCD74/CXCR4在CAFs與B細胞、DC、MDSCs、單核或巨噬細胞、NK細胞和T細胞的相互作用中位居首位。腫瘤細胞和CAFs是MIF配體作用于MDSCs、單核或巨噬細胞和DC的主要來源(圖4d)。lpmCAFs和lpCAFs是最主要的MIF配體來源(圖4e-h)。MIF的表達主要來源于CD36+ CAFs和lpCAFs，它們是MIF配體作用于MDSCs和DCs的主要來源(圖4i)。
作者使用SCENIC識別了CAF亞型中高度活躍的TF及其target(圖5a，b)。
這些結果確定了在已確定的CAF亞型中驅動或維持基因表達程序的關鍵TF，為肝癌腫瘤CAF異質性背后的基因調控網絡提供了進一步的見解。
在所有已知的配體-受體對中，MIF信號通路主要由MIF配體及其CD74/CXCR4受體主導，通常高表達CD36的lpmCAFs和lpCAFs是作用于MDSCs的MIF配體的最主要來源(圖4g)。免疫組化實驗表明，CD36的表達主要位于HCC間質區。因此，使用特異性表面標記物在lpmCAFs 和lpCAFs這兩個亞簇中鑒定了CD36，發現它們都富集在脂肪形成途徑中(圖5g)，表明它們在HCC進展中起著至關重要的作用。MIF實驗表明，CD36+ CAFs特異性浸潤于腫瘤組織(圖5h，i)。
scRNA-seq數據和TCGA數據顯示CD36+ CAFs與MDSCs呈正相關，與效應T細胞呈負相關(圖5j-l)。此外，對12例HCC腫瘤進行snRNA-seq，發現CD36+ CAFs的數量與MDSCs呈正相關(圖5m)。這些結果表明CD36+CAFs可能在HCC中具有有效的免疫抑制作用。
為了分離和表征CAF亞群，作者首先確定了在每個CAF亞群中唯一表達的表面蛋白。在排除免疫細胞和上皮細胞后，鎖定了ACTA2陽性細胞(圖6a)。使用CD36、CD146、FAP和MHCII抗體，CAFs被分離成4個群體：(1)CD36陽性、(2)MHCII陽性、(3)FAP陽性和(4)CD146陽性細胞，分別對應CD36+ CAFs、apCAFs、mCAFs和vCAFs(圖6a)。
CD31和EpCAM雙陰性人群中，小鼠和人HCC腫瘤中CAF亞型的比例大致相似(圖6b)。CD36陽性CAFs在Cd36、Fabp4和Sh3bp5以及lpCAF標記Fabp5、Apoc1和Fasn的高表達方面是獨特的(圖6c)。CD36+ CAFs在肝星狀細胞(HSCs)中也發現了高表達基因，如Lrat和Gfap31，作者猜測CD36+ CAFs可能起源于HSC。在小鼠肝癌腫瘤中，大約96%的CD36+ACTA2+成纖維細胞是Lrat系陽性細胞。這些結果表明，Lrat系間質細胞是小鼠肝癌發展過程中CD36+ CAFs的主要來源。
qPCR和ELISA實驗表明，CD36+ CAFs衍生的MIF表達明顯高于vCAFs、mCAFs、apCAFs和HSC(圖6d，e)。在CD36+ CAFs中沉默CD36時，MIF的表達和分泌減少，表明MIF的表達可能受到CD36的調控(圖6f)。這些結果表明CD36+ CAFs可能通過旁分泌信號促進MDSCs中某些腫瘤促進功能的獲得。（CD36是一種清道夫受體，在脂質代謝中起作用，據報道參與炎癥反應和代謝障礙，如糖尿病和肥胖。在免疫系統中，CD36已被報道介導樹突狀細胞抗原的獲取和呈遞，并支持調節性Tf細胞功能。）
OxLDL是組織中磷膽堿(OxPL)的另一個豐富來源。CD36+ CAFs比CD36kd CAFs具有更高的OxLDL攝取率，CD36+ CAFs脂質過氧化顯著增加，并且OxLDL以劑量依賴的方式增強CD36+ CAFs中的脂質過氧化(圖6i-l)。
氧化應激可激活p38激酶及其下游信號通路。OxLDL在CD36+ CAFs中誘導p38磷酸化(圖6n，m)。這表明OxLDL通過CD36和脂質過氧化促進p38激活。接下來，在p38抑制劑SB203580存在或不存在的情況下，用OxLDL處理CD36+ CAFs。結果顯示，OxLDL存在時，p38抑制部分抑制了MIF的分泌(圖6o)，表明OxLDL部分通過p38激活促進了MIF的分泌。
對脂質代謝至關重要的CEBP家族(CEBPA和CEBPD)TF在CD36+ CAFs(包括lpmCAFs和lpCAFs)中特異性富集。當CEBPA和CEBPD分別沉默時， OxLDL處理的CD36+ CAFs中MIF顯著降低(圖6p)。染色質免疫沉淀(ChIP)結果顯示CEBPA和CEBPD都可以直接與MIF啟動子結合(圖6p)。總的來說，這些結果表明CD36通過脂質過氧化/p38/CEBP軸介導OxLDL攝取促進MIF表達。
作者實驗發現CD36+ CAF-CM，MIF增加CD33+ MDSCs的數量，CD36+ CAF-CM+ ISO-1和CD36+CAF-CM+ CD74阻斷蛋白在抑制CD33+ MDSC擴張方面表現出良好的活性(圖7c)，這表明MIF分泌是CD36+ CAFs調節MDSC擴張的重要中介。
共注射從小鼠肝癌腫瘤中分離出的CD36+ CAFs可顯著促進小鼠肝臟中肝癌腫瘤細胞的生長或轉移，特異性下調CD36、抑制MIF或消耗Gr-1+ MDSCs可大大減弱這種作用(圖7d，e)。共注射CD36+ CAFs可顯著增加Treg的浸潤，減少腫瘤中效應CD8+ T細胞的浸潤，特異性下調CD36、抑制MIF或耗損Gr-1+ MDSCs也可顯著減弱這種作用(圖7f，g)。這些數據表明CD36+ CAFs的促瘤作用是由MDSCs的免疫抑制功能間接介導的。
MDSCs可以通過幾種接觸非依賴性機制促進免疫抑制，包括誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達，已知iNOS可抑制實體腫瘤中CD8+ T和NK細胞的細胞毒性和功能。首先，作者發現來自CD74或MDSC阻斷的細胞的CD36+ CAF-MDSC-CM顯著促進了MDSCs中iNOS的分泌(圖7h)。此外，共培養實驗顯示，CD36+ CAF+ MDSC組CD69+、IFNG+ CD8+ T細胞比例明顯下調，但Tregs和PD1+CD8+ T細胞比例上調，而CD36+ CAFs+ MDSC+ ISO-1或CD74阻斷的影響較小(圖7i、j)。這表明CD36+ CAFs通過MIF/CD74/ iNOS軸以成纖維細胞CD36依賴的方式增強CD33+ MDSCs的免疫抑制能力。
腫瘤細胞成球實驗結果顯示，CD36+ CAF-MDSC-CM極大地促進了HCC細胞系中腫瘤球的形成效率，而CD36+ CAFs或CD33+ MDSCs對CM的刺激只引起輕微的影響。這些結果表明CD36+ CAFs通過旁分泌MIFCD74軸以成纖維細胞CD36依賴的方式增強CD33+ MDSCs的干性增強能力。
最后，為了探索CD36+ CAF衍生的MIF影響MDSCs的分子機制。NF-κB信號通路在CD36+ CAF衍生MIF預處理的MDSCs中被激活(圖7k，l)。CD36+ CAFs誘導MDSCs中p65的磷酸化增加(圖7m)。據報道，p65激活可顯著誘導iNOS和IL-6分泌。CD36+ CAFs或MIF誘導的MDSCs iNOS和IL-6分泌顯著上調(圖5n)。
為了進一步研究CD36+和MIF+ CAFs是否在HCC的發生中起作用。在小鼠體內敲除CD36或MIF后，HCC腫瘤負荷和MDSCs比例顯著降低(圖8a-d)，表明CD36+ CAFs參與了HCC的發生。據報道，單核細胞MDSCs具有免疫抑制作用，并與癌癥免疫治療反應差相關。靶向治療或減少MDSCs聯合免疫檢查點阻斷劑可以增強T細胞免疫治療。假設CD36+ CAFs的數量與HCC患者免疫治療的療效有關。
首先研究了接受抗PD-1治療的患者。結果顯示，抗PD-1應答組CD36和αSMA共表達低于無應答組，表明CD36+ CAFs數量較低預示著更好的HCC免疫治療應答(圖8e，f)。然后，作者又討論了單藥和聯合治療策略。聯合治療在這些HCC小鼠模型中表現出顯著的抗腫瘤療效(圖8g-k)，Treg和MDSCs的比例下降，IFN-γ+和顆粒酶B+ CD8+ T細胞的比例增加(圖8l-m)。
作者使用scRNA-seq全面描繪了人類HCC的轉錄組景觀，并在單細胞分辨率上揭示了HCC細胞、MDSCs和CD36+ CAFs之間的相互作用。CD36+ CAFs表現出高水平的脂質代謝和巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)表達，CD36+CAFs來源于肝星狀細胞。此外，CD36在CD36+ CAFs中通過脂質過氧化/p38/CEBPs軸介導氧化性LDL攝取依賴的MIF表達，CD36+ CAFs以MIF和cd74依賴的方式招募CD33+MDSCs。CD36+ CAFs與HCC細胞共植入促進HCC在體內的進展。最后，CD36抑制劑與抗PD-1免疫治療協同作用，通過恢復HCC中的抗腫瘤T細胞反應。
