CAF新亞型——CD36+CAF

給大家分享一篇剛剛發(fā)表在Cell Discovery（IF：38.079）上的文章。作者根據(jù)人類和小鼠HCC腫瘤的單細(xì)胞RNA測序顯示CAF的異質(zhì)性。這項工作闡明了特定CAF亞群功能在理解腫瘤微環(huán)境和免疫系統(tǒng)之間相互作用的重要性。

背景

肝細(xì)胞癌(HCC)是一種具有高度細(xì)胞異質(zhì)性的免疫治療耐藥惡性腫瘤。細(xì)胞類型的多樣性以及腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞之間的相互作用仍有待闡明。80%以上的HCC病例以成纖維細(xì)胞的激活、增殖和積累引起的廣泛肝纖維化為特征。HCC的腫瘤微環(huán)境（TME）的一個顯著特征是大量的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs），它可以分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子，直接或間接地支持癌細(xì)胞。這些CAF衍生因子對癌細(xì)胞來說不僅是直接的生存信號，也通過抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的活性和招募免疫抑制細(xì)胞來改變免疫細(xì)胞環(huán)境，使癌細(xì)胞能夠逃避免疫監(jiān)視。在HCC中，基質(zhì)異質(zhì)性，特別是CAFs，以及惡性細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在單細(xì)胞分辨率下的相互作用仍然知之甚少。盡管先前的研究報道了CAFs通過各種機制調(diào)節(jié)肝癌的進展，而不管腫瘤中的CAF亞型如何，目前尚不清楚HCC中是否存在不同的CAF亞群的原機制，而且CAFs與TME中其他成分之間的復(fù)雜串?dāng)_仍不清楚，特別是對于不同CAF亞型。

結(jié)果解讀

人類HCC腫瘤的復(fù)雜性

來自未治療的HBV相關(guān)HCC（與乙型肝炎病毒有關(guān)的肝癌）患者的7個腫瘤和其中4個患者的相鄰肝組織的90572個細(xì)胞(圖1a，b)。使用已知的標(biāo)記基因可以將細(xì)胞劃分為9種不同的細(xì)胞類型。值得注意的是，上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞以及包括MDSCs、T細(xì)胞、DC和CAFs在內(nèi)的其他細(xì)胞具有高度的患者特異性，這表明HCC樣本之間存在顯著的分子瘤間異質(zhì)性。

HCC中5種CAF亞型的鑒定和分子特征

80%以上的HCC病例以成纖維細(xì)胞活化和聚集引起的廣泛肝纖維化為特征(圖1d)。每個亞簇顯示出不同的轉(zhuǎn)錄組特征(圖1e-g)。

• 亞簇0 CAF：命名為血管CAFs(vCAFs)；
• 亞簇1 CAF：脂質(zhì)加工mCAFs(lpmCAFs)，該亞簇可能同時參與ECM和膽固醇代謝；
• 亞簇2 CAF：命名為為matrix CAFs(mCAFs)；
• 亞簇3 CAF：脂質(zhì)加工CAFs(lpCAFs)， 蛋白-脂復(fù)合物重塑和脂肪酸代謝標(biāo)志顯著富集;
• 亞簇4 CAF：抗原呈遞CAFs(apCAFs)。

小鼠HCC腫瘤中CAF亞概括了人類HCC中發(fā)現(xiàn)的亞型

接下來，作者進行了更深入的CAF表征，將研究擴展到小鼠HCC模型(圖2a，b)。HCC腫瘤中成纖維細(xì)胞的比例與人類HCC樣本中相似。除膽管細(xì)胞外，所有小鼠HCC腫瘤中存在所有類型的細(xì)胞。

從7個小鼠肝癌腫瘤的CAFs聚類為7個亞群，每個子簇顯示出不同的轉(zhuǎn)錄組特征(圖2c-e)。人類HCC腫瘤中發(fā)現(xiàn)的所有5種CAF亞型在小鼠HCC組織中也有表達(圖2c)。CD36+CAFs和lpCAFs富集了上調(diào)通路，包括ROS通路和膽固醇代謝(圖2f)。

小鼠和人類HCC組織中CAFs的空間異質(zhì)性

mIF檢測發(fā)現(xiàn)CD36+ CAFs在人類和小鼠HCC腫瘤的腫瘤核心區(qū)域比腫瘤周圍區(qū)域更富集。此外，BCLC-B中l(wèi)pmCAFs和lpCAFs的豐度比在BCLC-A期HCC中更豐富。使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)分離人類相鄰肝組織中的成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞可以聚集成相同的5種CAF亞型。CD36+ CAFs在HCC腫瘤中特異性富集(圖3a，b)，而vCAFs在腫瘤中的數(shù)量略高于鄰近肝組織(圖3b，c)，這些結(jié)果在獨立數(shù)據(jù)集中得到了驗證（圖3d，e)。

不同CAF亞群的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變軌跡

偽時序分析表明狀態(tài)轉(zhuǎn)換軌跡包含兩個譜系，呈現(xiàn)出從祖細(xì)胞狀態(tài)到終端效應(yīng)狀態(tài)的分叉結(jié)構(gòu)(圖3f，g)。兩個譜系都從“祖細(xì)胞”狀態(tài)開始，在中間狀態(tài)之后發(fā)散。觀察到以CAF轉(zhuǎn)分化為特征的mCAFs位于祖細(xì)胞狀態(tài)，lpmCAFs(CD36+ CAFs)處于中間狀態(tài)，最終分化為vCAFs、lpCAFs和apCAFs，向最終效應(yīng)狀態(tài)動態(tài)過渡。

不同CAFs與MDSCs的相互作用及其機制

之后，作者進行了細(xì)胞間相互作用分析。在9種細(xì)胞組中檢測到71對顯著配體受體對，并將其進一步分為25條信號通路(圖4a）。MIFCD74/CXCR4在CAFs與B細(xì)胞、DC、MDSCs、單核或巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和T細(xì)胞的相互作用中位居首位。腫瘤細(xì)胞和CAFs是MIF配體作用于MDSCs、單核或巨噬細(xì)胞和DC的主要來源(圖4d)。lpmCAFs和lpCAFs是最主要的MIF配體來源(圖4e-h)。MIF的表達主要來源于CD36+ CAFs和lpCAFs，它們是MIF配體作用于MDSCs和DCs的主要來源(圖4i)。

CAF亞型特異性轉(zhuǎn)錄因子和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

作者使用SCENIC識別了CAF亞型中高度活躍的TF及其target(圖5a，b)。

• vCAFs上調(diào)MEF2C的靶基因MYLK、ACTA2和MYH11(圖5d)；
• mCAFs上調(diào)TWIST1和CREB3L1；
• lpmCAFs (CD36+ CAFs)高表達CEBPD和 脂蛋白脂肪酶(LPL)靶基因，CEBPD是一種已知的控制脂質(zhì)代謝和EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄程序的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子；
• lpCAFs也高表達CEBPD，此外還有CEBPA和MAFB；
• apCAFs高表達IKZF1和RUNX3，這與巨噬細(xì)胞極化和T細(xì)胞募集有關(guān)。(圖5a；c)

這些結(jié)果確定了在已確定的CAF亞型中驅(qū)動或維持基因表達程序的關(guān)鍵TF，為肝癌腫瘤CAF異質(zhì)性背后的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了進一步的見解。

CD36+ CAFs與MDSCs呈正相關(guān)，在HCC腫瘤中與MDSCs接近

在所有已知的配體-受體對中，MIF信號通路主要由MIF配體及其CD74/CXCR4受體主導(dǎo)，通常高表達CD36的lpmCAFs和lpCAFs是作用于MDSCs的MIF配體的最主要來源(圖4g)。免疫組化實驗表明，CD36的表達主要位于HCC間質(zhì)區(qū)。因此，使用特異性表面標(biāo)記物在lpmCAFs 和lpCAFs這兩個亞簇中鑒定了CD36，發(fā)現(xiàn)它們都富集在脂肪形成途徑中(圖5g)，表明它們在HCC進展中起著至關(guān)重要的作用。MIF實驗表明，CD36+ CAFs特異性浸潤于腫瘤組織(圖5h，i)。

scRNA-seq數(shù)據(jù)和TCGA數(shù)據(jù)顯示CD36+ CAFs與MDSCs呈正相關(guān)，與效應(yīng)T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(圖5j-l)。此外，對12例HCC腫瘤進行snRNA-seq，發(fā)現(xiàn)CD36+ CAFs的數(shù)量與MDSCs呈正相關(guān)(圖5m)。這些結(jié)果表明CD36+CAFs可能在HCC中具有有效的免疫抑制作用。

流式細(xì)胞術(shù)分離肝癌CAF亞型

為了分離和表征CAF亞群，作者首先確定了在每個CAF亞群中唯一表達的表面蛋白。在排除免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞后，鎖定了ACTA2陽性細(xì)胞(圖6a)。使用CD36、CD146、FAP和MHCII抗體，CAFs被分離成4個群體：(1)CD36陽性、(2)MHCII陽性、(3)FAP陽性和(4)CD146陽性細(xì)胞，分別對應(yīng)CD36+ CAFs、apCAFs、mCAFs和vCAFs(圖6a)。

CD31和EpCAM雙陰性人群中，小鼠和人HCC腫瘤中CAF亞型的比例大致相似(圖6b)。CD36陽性CAFs在Cd36、Fabp4和Sh3bp5以及l(fā)pCAF標(biāo)記Fabp5、Apoc1和Fasn的高表達方面是獨特的(圖6c)。CD36+ CAFs在肝星狀細(xì)胞(HSCs)中也發(fā)現(xiàn)了高表達基因，如Lrat和Gfap31，作者猜測CD36+ CAFs可能起源于HSC。在小鼠肝癌腫瘤中，大約96%的CD36+ACTA2+成纖維細(xì)胞是Lrat系陽性細(xì)胞。這些結(jié)果表明，Lrat系間質(zhì)細(xì)胞是小鼠肝癌發(fā)展過程中CD36+ CAFs的主要來源。

CD36在CD36+ CAFs中介導(dǎo)OxLDL攝取促進MIF表達

qPCR和ELISA實驗表明，CD36+ CAFs衍生的MIF表達明顯高于vCAFs、mCAFs、apCAFs和HSC(圖6d，e)。在CD36+ CAFs中沉默CD36時，MIF的表達和分泌減少，表明MIF的表達可能受到CD36的調(diào)控(圖6f)。這些結(jié)果表明CD36+ CAFs可能通過旁分泌信號促進MDSCs中某些腫瘤促進功能的獲得。（CD36是一種清道夫受體，在脂質(zhì)代謝中起作用，據(jù)報道參與炎癥反應(yīng)和代謝障礙，如糖尿病和肥胖。在免疫系統(tǒng)中，CD36已被報道介導(dǎo)樹突狀細(xì)胞抗原的獲取和呈遞，并支持調(diào)節(jié)性Tf細(xì)胞功能。）

OxLDL是組織中磷膽堿(OxPL)的另一個豐富來源。CD36+ CAFs比CD36^kd CAFs具有更高的OxLDL攝取率，CD36+ CAFs脂質(zhì)過氧化顯著增加，并且OxLDL以劑量依賴的方式增強CD36+ CAFs中的脂質(zhì)過氧化(圖6i-l)。

氧化應(yīng)激可激活p38激酶及其下游信號通路。OxLDL在CD36+ CAFs中誘導(dǎo)p38磷酸化(圖6n，m)。這表明OxLDL通過CD36和脂質(zhì)過氧化促進p38激活。接下來，在p38抑制劑SB203580存在或不存在的情況下，用OxLDL處理CD36+ CAFs。結(jié)果顯示，OxLDL存在時，p38抑制部分抑制了MIF的分泌(圖6o)，表明OxLDL部分通過p38激活促進了MIF的分泌。

對脂質(zhì)代謝至關(guān)重要的CEBP家族(CEBPA和CEBPD)TF在CD36+ CAFs(包括lpmCAFs和lpCAFs)中特異性富集。當(dāng)CEBPA和CEBPD分別沉默時， OxLDL處理的CD36+ CAFs中MIF顯著降低(圖6p)。染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)結(jié)果顯示CEBPA和CEBPD都可以直接與MIF啟動子結(jié)合(圖6p)。總的來說，這些結(jié)果表明CD36通過脂質(zhì)過氧化/p38/CEBP軸介導(dǎo)OxLDL攝取促進MIF表達。

CD36+ CAF衍生的MIF通過IL-6/STAT3激活增強MDSCs促進免疫抑制TME和腫瘤干性的能力

作者實驗發(fā)現(xiàn)CD36+ CAF-CM，MIF增加CD33+ MDSCs的數(shù)量，CD36+ CAF-CM+ ISO-1和CD36+CAF-CM+ CD74阻斷蛋白在抑制CD33+ MDSC擴張方面表現(xiàn)出良好的活性(圖7c)，這表明MIF分泌是CD36+ CAFs調(diào)節(jié)MDSC擴張的重要中介。

共注射從小鼠肝癌腫瘤中分離出的CD36+ CAFs可顯著促進小鼠肝臟中肝癌腫瘤細(xì)胞的生長或轉(zhuǎn)移，特異性下調(diào)CD36、抑制MIF或消耗Gr-1+ MDSCs可大大減弱這種作用(圖7d，e)。共注射CD36+ CAFs可顯著增加Treg的浸潤，減少腫瘤中效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞的浸潤，特異性下調(diào)CD36、抑制MIF或耗損Gr-1+ MDSCs也可顯著減弱這種作用(圖7f，g)。這些數(shù)據(jù)表明CD36+ CAFs的促瘤作用是由MDSCs的免疫抑制功能間接介導(dǎo)的。

MDSCs可以通過幾種接觸非依賴性機制促進免疫抑制，包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達，已知iNOS可抑制實體腫瘤中CD8+ T和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和功能。首先，作者發(fā)現(xiàn)來自CD74或MDSC阻斷的細(xì)胞的CD36+ CAF-MDSC-CM顯著促進了MDSCs中iNOS的分泌(圖7h)。此外，共培養(yǎng)實驗顯示，CD36+ CAF+ MDSC組CD69+、IFNG+ CD8+ T細(xì)胞比例明顯下調(diào)，但Tregs和PD1+CD8+ T細(xì)胞比例上調(diào)，而CD36+ CAFs+ MDSC+ ISO-1或CD74阻斷的影響較小(圖7i、j)。這表明CD36+ CAFs通過MIF/CD74/ iNOS軸以成纖維細(xì)胞CD36依賴的方式增強CD33+ MDSCs的免疫抑制能力。

腫瘤細(xì)胞成球?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，CD36+ CAF-MDSC-CM極大地促進了HCC細(xì)胞系中腫瘤球的形成效率，而CD36+ CAFs或CD33+ MDSCs對CM的刺激只引起輕微的影響。這些結(jié)果表明CD36+ CAFs通過旁分泌MIFCD74軸以成纖維細(xì)胞CD36依賴的方式增強CD33+ MDSCs的干性增強能力。

最后，為了探索CD36+ CAF衍生的MIF影響MDSCs的分子機制。NF-κB信號通路在CD36+ CAF衍生MIF預(yù)處理的MDSCs中被激活(圖7k，l)。CD36+ CAFs誘導(dǎo)MDSCs中p65的磷酸化增加(圖7m)。據(jù)報道，p65激活可顯著誘導(dǎo)iNOS和IL-6分泌。CD36+ CAFs或MIF誘導(dǎo)的MDSCs iNOS和IL-6分泌顯著上調(diào)(圖5n)。

靶向CD36與免疫治療在HCC小鼠模型中的協(xié)同作用

為了進一步研究CD36+和MIF+ CAFs是否在HCC的發(fā)生中起作用。在小鼠體內(nèi)敲除CD36或MIF后，HCC腫瘤負(fù)荷和MDSCs比例顯著降低(圖8a-d)，表明CD36+ CAFs參與了HCC的發(fā)生。據(jù)報道，單核細(xì)胞MDSCs具有免疫抑制作用，并與癌癥免疫治療反應(yīng)差相關(guān)。靶向治療或減少MDSCs聯(lián)合免疫檢查點阻斷劑可以增強T細(xì)胞免疫治療。假設(shè)CD36+ CAFs的數(shù)量與HCC患者免疫治療的療效有關(guān)。

首先研究了接受抗PD-1治療的患者。結(jié)果顯示，抗PD-1應(yīng)答組CD36和αSMA共表達低于無應(yīng)答組，表明CD36+ CAFs數(shù)量較低預(yù)示著更好的HCC免疫治療應(yīng)答(圖8e，f)。然后，作者又討論了單藥和聯(lián)合治療策略。聯(lián)合治療在這些HCC小鼠模型中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤療效(圖8g-k)，Treg和MDSCs的比例下降，IFN-γ+和顆粒酶B+ CD8+ T細(xì)胞的比例增加(圖8l-m)。

總結(jié)

作者使用scRNA-seq全面描繪了人類HCC的轉(zhuǎn)錄組景觀，并在單細(xì)胞分辨率上揭示了HCC細(xì)胞、MDSCs和CD36+ CAFs之間的相互作用。CD36+ CAFs表現(xiàn)出高水平的脂質(zhì)代謝和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)表達，CD36+CAFs來源于肝星狀細(xì)胞。此外，CD36在CD36+ CAFs中通過脂質(zhì)過氧化/p38/CEBPs軸介導(dǎo)氧化性LDL攝取依賴的MIF表達，CD36+ CAFs以MIF和cd74依賴的方式招募CD33+MDSCs。CD36+ CAFs與HCC細(xì)胞共植入促進HCC在體內(nèi)的進展。最后，CD36抑制劑與抗PD-1免疫治療協(xié)同作用，通過恢復(fù)HCC中的抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)。