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一文告訴你“可變剪接”怎么發10分+
可變剪接(Alternative splicing, AS)在基因調控過程中起著重要作用，在癌癥中很常見。RNA結合蛋白(RNA binding protein, RBP)是AS的分子決定因素之一，并且，RBP-基因網絡活性的擾動可能在一定程度上促進癌癥的發展。近年來關于可變剪接的文章層出不窮，今天分享一篇2021年6月發表在Molecular Therapy-Nucleic Acids（IF: 10.183）的文章。這篇文章綜合AS擾動景觀分析識別了RBPs在癌癥中的潛在治療靶點，并為RBPs在癌癥中的調節功能提供了新的見解。感興趣就一起往下看看吧！
可變剪接（AS）在基因表達的轉錄后調控中起著關鍵作用。AS的擾動已經在各種類型的癌癥中被發現，并且已經證明AS可能會激活各種癌癥信號通路。此外，AS事件在癌癥組織中的臨床意義已被證明。盡管幾個候選基因中的AS事件已被確定為有助于癌癥的發展，但在整個轉錄組范圍內的癌癥特定或復發性剪接模式卻較少被研究。識別這些擾亂AS的分子調控對開發癌癥生物標志物和治療靶點至關重要。
隨著計算和實驗技術的發展，癌癥中AS事件的遺傳和表觀遺傳決定因素已被發現。AS的失調可能受到體細胞突變、反義RNA、RNA結合蛋白（RBPs）、轉錄因子（TFs）和表觀遺傳因子的調控。最近的研究還發現，可能調節AS事件的體細胞突變在RBPs中富集。RBPs在癌癥的發生和發展中起著不可缺少的作用。越來越多的RBPs被確定為各種類型癌癥中AS事件的調節器。例如，RBP RALY促進了乳腺癌中精氨酸甲基轉移酶1的交替剪接異構體V2的表達和轉移潛力。RBP ZMAT3是抑制結直腸癌中CD44剪接的調節因子。研究還發現，EIF2S2敲除聯合奧沙利鉑治療可能是一種潛在的癌癥聯合治療方法。
本文系統地分析了不同癌癥類型的全基因組替代剪接擾動。作者還提出了一個計算管道，以確定AS擾動的RBP調節器，并發現這些RBP調節器在癌癥標志相關途徑中發揮重要作用。此外，研究人員根據RBP調節器的表達確定了不同的亞型，這些亞型的患者表現出不同的生存和通路活性。文章最后還確定了藥物與RBP的相關性，這為癌癥治療提供了新的潛在藥物。
癌癥中受干擾的AS事件的景觀
為了確定AS在不同癌癥類型中的全面失調，作者系統地分析了TCGA隊列中18種人類癌癥的mRNA剪接譜（圖1A）。總共有7245個癌癥樣本和735個正常樣本。在所有的癌癥類型中，發現了大量的剪接事件，而且不同的癌癥類型之間剪接類型的比例沒有太大差異（圖1B）。分析中總共考慮了七種類型的AS事件，包括外顯子跳躍（ES），替代供體位點（AD），替代接受體位點（AA），保留內含子（RI），互斥外顯子（ME），替代終止子（AT），以及替代啟動子（AP）。最常見的剪接事件是ES，占整個癌癥總事件的34.5%-41.4%（圖1B）。相比之下，最不常見的AS事件是ME，它只占整個癌癥類型總事件的0.3%-0.6%。接下來作者確定了每種癌癥類型中的擾動AS事件(perturbed AS events, PASEs)。研究發現在癌癥中AS事件被擾亂的比例很高，不同癌癥類型的PASEs數量不同（圖1C，頂部）。作者將具有較高剪接百分比（PSI）值的AS事件定義為癌癥中的上調AS事件，而具有較低PSI值的AS事件被指定為下調AS事件。在KIRC和胃腺癌（STAD；圖1C）中發現了更多上調的AS事件。在乳腺浸潤癌（BRCA）、多形性膠質母細胞瘤（GBM）和甲狀腺癌（THCA；圖1C）中有更多下調的AS事件。作者還探討了不同AS類型在癌癥中被擾亂的程度。計算了每種類型的AS事件的概率（OR）。雖然ES事件被擾亂的數量較多，但PASEs可能在AP和AT類型中富集（圖1C；底部）。此外，癌癥中上調的PASEs在不同的癌癥中也富集于RI剪接類型（圖1C；底部）。這與最近觀察到的RI是癌癥干性和侵襲性的標志是一致的。這些結果表明，在不同的癌癥類型中普遍存在AS的改變。
PASEs提示腫瘤的組織起源
具有相似組織起源的癌癥類型往往具有一些共同的分子特征，如基因表達和DNA甲基化。作者接下來調查了具有相似組織起源的癌癥類型是否表現出相似的PASEs。首先用t分布的隨機鄰接嵌入（t-SNE）將整個癌癥隊列的AS多樣性可視化。這突出了AS事件的組織特異性和癌癥類型的差異和共性（圖2A）。文章發現了起源相似且經常被描述為具有類似分子特征的癌癥類型，如腎臟腎乳頭狀細胞癌（KIRP）、KIRC和腎臟嗜鉻細胞（KICH），肝臟肝細胞癌（LIHC）和膽管癌（CHOL），或結腸腺癌（COAD）和直腸腺癌（READ），通常被緊密地聚在一起（圖2A）。此外，作者還計算了兩個癌癥之間的相似性，即兩個癌癥中的PASEs的Jaccard指數。根據以共享PASEs的比例計算的相似性聚類，觀察到了類似的模式（圖2B）。這些結果與以前專注于表達和甲基化分析的研究一致，并表明相關的AS機制可能在具有類似組織來源的癌癥類型中運作。接下來，作者調查了PASEs對癌癥特異性的貢獻程度。盡管大量的PASEs顯示出癌癥的特異性，但一些PASEs參與了許多癌癥類型（圖2C）。作者將這些AS事件定義為泛癌癥AS事件。這些泛癌差異性AS事件涉及到一些著名的致癌基因（如NFE2L2、RARA和SGK1）、腫瘤抑制基因（如CASP8、DNMT3A、FANCD2和SMARCA4）以及融合基因。這些泛PASEs中的大多數都與患者的生存期有關，它們在各種癌癥類型中的表現相似。作者接下來對這些泛癌基因進行了功能富集分析。泛癌PASE參與的基因在一些癌癥相關的功能類別中富集（圖2D），如翻譯啟動，蛋白質結合，以及參與細胞-細胞粘附。此外，這些基因在睪丸、K562和結直腸腺癌中表現出組織特異性高表達（圖2D）。綜上所述，這些結果意味著剪接異常通過調節癌癥相關的途徑影響癌癥生物學。
擾動AS事件與疾病嚴重程度相關
為了確定與癌癥中受干擾的PASEs相關的分子參與者，作者設計了一個工作流程來識別RBP調節因子(圖3A)。首先將PSI與正常樣本進行比較，構建了每例患者的AS活動擾動譜。基于同一患者各AS事件的擾動水平，計算出兩個活動評分(激活活動[SA]和抑制活動[SR])。其次，作者通過計算RBP的表達與AS活動評分的Spearman相關系數，確定了在癌癥中表現出轉錄組干擾的RBP。
作者手工收集了2038個RBPs，并進一步將它們分為九個群組（圖3B）。其中有139個核糖體蛋白，636個mRNAs和89個非編碼RNAs（ncRNAs）。接下來作者探討了RBP表達和AS擾動分數之間的相關性。AS擾動分數（SA或SR）較高的患者也可能表現出較高的疾病嚴重性（圖3C）。作者還比較了不同AS擾動分數的患者的生存率。結果發現在各種癌癥類型中，SA較高或SR較高的患者可能表現出較差的生存率。特別是KIRC和LIHC中SA或SR較高的患者，其生存期明顯較差（圖3D）。通過整合年齡、性別和腫瘤階段進行了多變量分析。我們發現，在KIRC和LIHC中，AS擾動的水平是一個獨立的風險因素。這些結果共同表明，AS擾動與疾病的嚴重程度有關，其中普遍存在的PASEs的癌癥患者表現出更差的生存。
AS相關RBP調節因子的識別
AS活性評分的紊亂與疾病的嚴重程度有關，作者假設其表達水平與這些評分相關的RBPs很可能在癌癥中調節AS。首先，作者確定了18種癌癥類型中差異表達的RBPs。分析發現更多的RBPs在癌癥中被上調（圖4A），作者還計算了這些RBPs差異表達的癌癥類型的數量。發現更多的RBPs只在一種癌癥類型中觀察到（圖4B），這表明不同的癌癥類型有不同的RBP失調特征。此外，在分析的18種癌癥類型中，有一些持續失調的RBPs。作者確定了246個RBPs在超過15種癌癥類型中持續上調或下調。在這些RBPs中，APOBEC3B、DCN、EZH2和RAD51AP1在所有18種癌癥類型中都有差異表達。APOBEC3B在癌癥中起著關鍵作用，并被報道在許多癌癥中被上調。作為染色質調控的主調控者，EZH2在人類上皮癌中被過度表達。大多數RBPs表現出持續的差異性表達。所有這些RBPs為確定癌癥的關鍵治療目標提供了寶貴的資源。
作者接下來根據RBP表達和AS活性評分之間的相關性，確定了不同癌癥類型的AS事件的潛在RBP調節器。在18種癌癥中，總共確定了1365個與活性評分相關的RBPs（ActRBPs）和1045個與抑制評分相關的RBPs（ResRBPs）。在15種或更多的癌癥類型中觀察到211個ActRBPs和91個ResRBPs（圖4C和4D）。此外，MEX3A、MRVI1、PUS7、FHL1和SYNE1被確定為頂級ResRBPs，它們與18種癌癥類型的AS活性相關。MEX3A是一個干性相關的基因，在細胞增殖中發揮重要作用，而FHL1在癌癥中發揮腫瘤抑制基因的功能，并被表觀遺傳信號所抑制。
泛癌RBP調節因子的功能
接下來，作者計算了每個RBP調節因子的癌癥類型數量，將RBP調節因子分為三種類型。僅發生于一種癌癥類型的RBPs被定義為癌癥特異性RBPs，在2-11種癌癥類型中發現的RBPs被定義為中度RBPs，在>11種癌癥中發現的RBPs被定義為泛癌癥RBPs(圖5A)。我們總共分別確定了302個和345個癌癥特異性ActRBPs和ResRBPs。泛癌ActRBPs和ResRBPs分別有71個和22個。這些泛癌癥RBPs可能調節不同癌癥類型的各種AS事件(圖5B)。特別是，ActRBP NME1和ResRBP SYNE1可能在癌癥中調節最多的AS事件。NME1是一種轉移抑制因子，可以在不影響原發腫瘤大小的情況下潛在地減少轉移。結果表明，NME1可能調節許多癌癥相關基因的AS，如CD44、CTNND、和PTBP2。這些結果表明，識別潛在的AS靶點提供了對RBP調節因子功能的見解。
為了研究這些泛癌RBPs的功能，作者接下來根據其調節的AS事件相關基因進行功能富集分析。作者專注于50個癌癥標志相關的通路。在錯誤發現率（FDR）<0.01時，在93個RBPs和16個通路中發現了442個RBP-通路關聯（圖5C）。結果發現，所有的泛癌RBPs都可能調節至少一個癌癥標志相關通路。此外，有更多的RBPs參與有絲分裂紡錘體、紫外線反應、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT-哺乳動物雷帕霉素（mTOR）靶向信號和脂肪生成。此外，作者發現RBPs在幾個與新陳代謝相關的通路中發揮了重要作用（圖5C）。事實上，越來越多的證據表明它們在新陳代謝中的作用。所有這些結果表明，泛癌RBPs通過調節AS事件在癌癥中發揮基本作用。
基于RBP的腎癌患者分層
越來越多的研究表明，AS事件能夠區分不同的癌癥亞型，而且對預后有影響。作者還發現，AS活動與疾病的嚴重程度有關，特別是在腎癌中。因此，作者接下來確定了RBP調節器，并調查了它們是否有助于癌癥的分子亞型劃分。作者重點關注兩種類型的腎癌（KIRC和KIRP）。文章從這兩種癌癥類型中確定了68個共同的RBP調節器（圖6A）。接下來，根據這些RBPs的表達，將腎癌患者分成不同的亞型。進行了一致性聚類，K值從2到10。這項分析顯示腎癌有四個亞型（圖6B）。C1、C2、C3和C4亞型中分別有298、76、426和26名患者。調查這些患者的來源，發現C1、C2和C4的大多數患者是KIRC。然而，C3亞型同時包括KIRC和KIRP患者。此外，作者還探討了不同亞型患者的臨床信息。發現C4型的患者被診斷的年齡明顯較小（圖6C）。在所有亞型中，C2亞型患者的年齡最高。作者還計算了高分期（iii和iv）和低分期（i和ii）患者的比例。C2和C4的高分期患者多于C1和C3（圖6D）。這些結果表明，C4的病人可能更嚴重，所以作者進一步調查了他們的生存率。發現C4的病人生存率最差（圖6E）。此外，C1的病人比C3的病人有更好的生存率。C2的患者也比C4的患者有更好的生存率。這些結果表明，常見的RBP調節器有助于識別癌癥的分子亞型。
腎癌亞型的不同癌癥通路
作者接下來調查了不同腎癌亞型的通路活動的差異程度。首先，GSVA分析計算了所有患者的50條癌癥標志相關的通路活性。接下來，通過方差分析（ANOVA）比較通路活性的差異。結果發現，這些通路中的80%（40/50）在C1-C4亞型中表現出不同的通路活性（圖7A）。特別是，C2和C4患者的通路活性明顯高于C1和C3亞型的患者（圖7B）。這些結果與C2和C4亞型患者的生存率較差是一致的。雖然C1和C3的患者之間，以及C2和C4的患者之間通路活性相似，但這幾組之間存在明顯的生存差異（圖6E）。作者還發現，膽汁酸代謝途徑在C1和C2亞型中顯示出更大的活性（圖7C），這可能是區分C1與C3、C2與C4亞型的潛在通路指標。膽汁酸在調節葡萄糖、脂質和能量代謝方面起著關鍵作用。此外，作者還調查了患者的免疫細胞浸潤水平。C1患者顯示出較高的免疫細胞浸潤水平。作者還探討了不同亞型中患者的突變情況。總共發現有五個基因在亞型中具有明顯的突變頻率。這些基因已被發現在癌癥中發揮關鍵作用，如VHL52和PBRM153。根據RBPs調控的AS事件，作者又將患者分為三個亞型。結果發現，這些集群與基于RBP表達的分類明顯重疊。接下來，作者在另兩個獨立的數據集中驗證了該分類。綜上所述，癌癥亞型之間的通路活動存在著明顯的差異，這為基于通路的癌癥治療提供了潛在的候選方案。
腫瘤中RBP的治療靶點
失調的RBPs可以影響癌癥的許多特征，這表明RBPs可能是癌癥治療的一個很好的治療靶點。接下來，為了確定癌癥治療的潛在RBP候選者，作者評估了不同癌癥類型的RBPs表達水平和藥物活性之間的相關性。結果發現，在10種癌癥中，有1,088個RBPs與藥物半數最大抑制濃度（IC50）值相關（圖8A）。作者關注KIRC中藥物-RBP的相關性，這些相關的RBP和藥物形成了一個密集的網絡（圖8B）。具體來說，作者發現幾種藥物，如培利替尼、馬西替尼和奧米帕利西布，與更多的RBPs相關。佩利替尼是一種有效的不可逆的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，目前正在進行治療癌癥的臨床試驗。此外，一些RBPs，如ATP5F1、BCAS2和RRP12，也與更多的藥物相關。這些RBPs已被證明在各種類型的癌癥中發揮關鍵作用。此外，作者提取了68個用于腎癌分型的RBP的子網絡。10種藥物可能與5種RBP的表達相關(圖8C)，包括SNRPD1、RNPS1、PPIA、MRPL14和PPIH。PPIH的表達與masitinib和QL-XII-47相關。接下來，作者通過將細胞系分為兩組來計算模擬RBP表達的改變。然后比較了RBP表達不同的兩組之間的IC50值，發現了顯著的組間差異。這些結果表明，RBP表達的改變可能影響細胞系的IC50。此外，PPIH高表達與較差的腎癌總生存率和無病生存率顯著相關(圖8 D)。這些結果提示這兩種藥物有可能用于癌癥治療。
總之，本文對AS擾動景觀的綜合分析確定了RBPs為癌癥的潛在治療目標。作者提出了一種識別RBP調節因子的計算流程。通過泛癌癥分析發現了一些保守的RBP調節因子。分析表明RBP調節因子的表達有助于癌癥亞型的分型，并為RBPs在癌癥中的調節功能提供了新的見解。
Li J, Pan T, Chen L, Wang Q, Chang Z, Zhou W, Li X, Xu G, Li X, Li Y, Zhang Y. Alternative splicing perturbation landscape identifies RNA binding proteins as potential therapeutic targets in cancer. Mol Ther Nucleic Acids. 2021 Apr 9;24:792-806. doi: 10.1016/j.omtn.2021.04.005 . PMID: 33996260; PMCID: PMC8099609.
