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Nature高分綜述：TNF致死導致炎癥疾病
腫瘤壞死因子(TNF)是炎癥反應的核心細胞因子，中和TNF的生物制劑是治療慢性炎癥和自身免疫病變的最成功藥物之一。近年來研究發現，TNF不僅可以通過直接誘導炎癥基因表達來驅動炎癥反應，還可以通過誘導細胞死亡、激發炎癥免疫反應和疾病發展來間接驅動炎癥反應。因此，細胞死亡抑制劑被認為是治療TNF依賴性炎癥性疾病的新方法。今天給大家介紹一篇2022年11月15日發表在Nature reviews, Immunology(IF: 108.555)的綜述，這篇文章詳細介紹了TNF在炎癥過程中的作用。
一. 研究背景
細胞死亡越來越被認為是炎癥疾病的主要驅動因素。與通常被認為是免疫沉默的細胞凋亡相比，細胞死亡的裂解形式（如壞死性凋亡、焦亡和凋亡驅動的繼發性壞死)會釋放細胞內因子，激活免疫受體和誘導炎癥反應。細胞死亡以其多種形式作為炎癥的起始或放大因素。然而，死亡并不是細胞的默認反應，除非某些細胞死亡檢查點被覆蓋，否則通常會被抑制。
越來越多的證據表明，在各種急慢性炎癥性疾病的小鼠模型中，阻斷細胞死亡可以逆轉炎癥病理狀態。因此需要進一步了解各種細胞死亡模式之間的相互作用，它們的執行模式，控制它們的分子檢查點，以及關閉它們的生理和病理條件，從而確定新的治療靶點。炎性細胞因子腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor , TNF)是協調炎性免疫反應的核心。因此，TNF中和療法在慢性炎癥和自身免疫病理的治療中非常成功。
這篇綜述簡要回顧了TNF作為治療靶點的歷史和發現，然后重點關注TNF通過誘導細胞死亡間接促進炎癥的最新發現。因此，直接抑制細胞死亡被認為是治療TNF介導的疾病的一種新的治療策略，特別是對抗TNF治療無效或出現不良反應的患者。
二. 主要結果
1. TNF的簡史
TNF被確定為一種血清因子，可以誘導急性細菌感染后的病人出現腫瘤的出血性壞死（圖1）。紐約外科醫生William Coley在近一個世紀前就已經利用了這種抗癌活性。后來，從細菌提取物中分離出脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，并在小鼠的實驗性癌癥研究中顯示能誘發一些腫瘤的消退。Carswell等人后來證明，殺死癌細胞的不是LPS本身，而是宿主巨噬細胞對LPS產生的一種壞死因子。 因此，這種壞死因子被命名為 "腫瘤壞死因子 "或 "TNF "。 在此后的幾年里，編碼人類和小鼠TNF和TNF受體的基因被純化、測序和克隆，并開始用重組TNF進行實驗研究，以驗證其治療癌癥的抗腫瘤潛力。然而，當重組細胞因子給藥會誘發嚴重的內毒素休克時，TNF成為一種強大的抗癌藥物的希望就破滅了。事實上，在這些癌癥研究之外，TNF被發現與先前確定的一種名為 "cachectin "的蛋白質相同，后者負責內毒素誘導的小鼠消耗性疾病(cachexia)（圖1）。這些發現表明，TNF是一種必須受到嚴格調控的多態性細胞因子。
圖1. TNF和TNF誘導的細胞死亡歷史中關鍵事件的時間軸
2. TNF誘導細胞死亡
抗TNF生物制劑治療炎癥性疾病的臨床成功歸因于其可有效阻斷TNF與其同源受體TNF受體1 (TNFR1)和TNFR2的結合。長期以來，人們認為這種阻斷可通過阻止TNFR1激活MAPK通路和NF-κB通路來減輕炎癥，否則這些通路將共同導致構成炎癥病理基礎的促炎基因的轉錄上調(圖2)。現在已經明確，TNF與TNFR1的結合也通過誘導細胞凋亡、壞死性凋亡或細胞焦亡的形式間接促進和加重炎癥。事實上，死亡細胞釋放的細胞內成分可誘導鄰近細胞的促炎基因表達。此外，上皮細胞死亡(皮膚或腸道內)可能影響屏障完整性，誘導微生物組織浸潤和炎癥(圖2)。因此，在TNF誘導的炎癥性疾病的各種小鼠模型中，細胞死亡的遺傳靶向被證明可逆轉炎癥表型。因此，目前正在研究抑制細胞死亡的藥物，如受體相互作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1 (RIPK1)抑制劑，作為TNF驅動的人類疾病的替代療法。
圖2. TNFR1介導的炎癥信號。
雖然TNFR1有能力引發細胞死亡，但這種反應只有在其中一個細胞死亡檢查點失活時才會進行（圖3）。TNFR1激活的生存與死亡結果取決于兩個不同的、但連續的蛋白復合物的組裝（圖3）。膜結合的復合物I在TNF感應的幾秒鐘內形成，并主要導致炎癥基因的激活。復合物I的組裝始于RIPK1和TNFR1相關死亡域蛋白（TRADD）與受體的細胞膜部分的結合，允許隨后招募TNFR相關因子2（TRAF2）和泛素連接酶細胞凋亡抑制因子1（cIAP1）、cIAP2和線性泛素鏈組裝復合物（LUBAC；由HOIL1、HOIP和SHARPIN組成）。這些E3連接酶共同產生了一個密集的泛素鏈網絡，允許進一步招募激活MAPK信號途徑的激酶和典型的NF-κB信號途徑。與復合物I相關的泛素網絡受到一組去泛素化酶的負向調節，包括A20、CYLD和OTULIN，它們破壞信號復合物的穩定性，并將信號限制在MAPKs和NF-κB上。
TNFR1信號如何進一步發展以誘導細胞死亡還不太清楚，但它需要組裝一個二級細胞膜復合物，稱為 "復合物II"，它源于FAS相關死亡域蛋白（FADD）與受體相關復合物I成分TRADD和/或RIPK1的結合。復合物II的功能是作為細胞膜平臺，用于結合和激活caspase 8，caspase 8可以處理下游效應caspase以誘導細胞凋亡，或者轉而裂解gasdermin D (GSDMD)以觸發熱凋亡。到目前為止，已經發現有兩個細胞死亡檢查點可以抑制這些死亡復合體誘導的細胞凋亡。第一個（"IKK檢查點"）發生在受體水平，在復合物I內，包括IKKα-IKKβ和TBK1-IKKε對RIPK1的磷酸化依賴性失活，從而阻止復合物IIb的組裝和隨后RIPK1激酶活性依賴性凋亡的誘導（圖3）。第二個細胞死亡檢查點（"NF-κB檢查點"）發生在該途徑的下游，在細胞核中，并依賴于NF-κB依賴的轉錄和翻譯上調的促生存蛋白。由于IKKα和IKKβ是典型的NF-κB途徑的上游激酶，它們控制著TNFR1下游的兩個連續的檢查點，分別保護細胞免受RIPK1激酶活性依賴性凋亡（IKK檢查點）和RIPK1激酶活性依賴性凋亡（NF-κB檢查點）（圖3）。控制上述兩個細胞死亡檢查點的激酶的激活高度依賴于與復合體I相關的泛素網絡。因此，影響復合物I泛素化的條件，如抑制cIAP1、cIAP2和LUBAC，以及RIPK1泛素接受位點K377（小鼠RIPK1的K376）的突變或A20和OTULIN的缺陷，間接擾亂這些細胞死亡檢查點并激活TNF的細胞毒性。值得注意的是，泛素對RIPK1死亡信號的抑制作用可以與它誘導NF-κB介導的基因轉錄的作用相分離。盡管上述兩個細胞死亡檢查點是為了抑制caspase 8的加工，但TNF感應仍激活了一個非致命的caspase 8池，并作為該途徑的第三個檢查點（"caspase 8檢查點"），它通過裂解RIPK1，防止RIPK1激酶活性依賴的細胞凋亡和壞死（圖3）。因此，根據細胞的情況，RIPK1的催化活性可以促進細胞凋亡、caspase 8介導的熱凋亡或TNFR1下游的壞死。
圖3. TNFR1的信號傳導和TNFR1通路中三個特征的細胞死亡檢查點的概述
迄今為止描述的所有三個細胞死亡檢查點都被證明是防止小鼠TNF依賴性胚胎死亡或嚴重炎癥病變的關鍵。此外，影響這些檢查點的突變已被確定為人類自體炎癥疾病的原因，進一步提供了這些細胞死亡檢查點的臨床意義。
3. 在病原體防御中TNF誘導的細胞死亡
宿主與病原體的相互作用是作用于兩種生物的主要選擇壓力。宿主必須適應病原體感染的生存，而病原體必須反過來發展機制以避免被宿主的免疫防御系統消滅。這種持續的壓力選擇了宿主的多種、分層和相互關聯的防御機制。同樣，病原體通過劫持炎癥信號通路或阻斷其他抗菌防御機制，發展出復雜的策略來規避宿主的免疫力。不同的TNFR1細胞死亡檢查點似乎已經進化為宿主對這種微生物劫持的反應。事實上，TNF信號旨在建立一個炎癥反應，主要是通過MAPK和NF-κB信號途徑促進炎癥基因的激活。激活這些信號通路的激酶也是破壞TNF細胞毒性的因素。因此，當病原體試圖通過提供影響這些激酶正常激活的毒力或效應因子來抑制宿主的炎癥基因激活時，細胞將轉換其反應以誘導細胞死亡，從而激活另一種途徑，通過釋放損傷相關分子模式來提醒免疫系統。然而，TNF的細胞死亡并不總是對宿主有利的反應。至少在某些特定情況下，TNF介導的細胞死亡的過度激活確實是推動而不是防止微生物的致病性和致命性。
4. 炎癥性疾病中TNF誘導的細胞死亡
雖然TNF誘導的細胞死亡可以幫助在微生物感染期間作出適當的免疫反應，但當環境因素或基因突變導致的異常誘導時，它也可以變成各種（無菌）炎癥性疾病的一個非常有害的過程。TNF不僅通過誘導炎癥介質的表達，而且還通過觸發細胞死亡來促進炎癥性疾病的發病機制。例如，TNF在小鼠中誘發致命的敗血癥休克，該休克是由RIPK1激酶活性依賴的細胞死亡引起的，因為對RIPK1酶活性的遺傳或藥物抑制可以完全保護小鼠免受TNF誘發的細胞因子風暴、低溫和發病的影響。caspase 8雜合體可部分挽救低體溫癥，而GSDMD缺失則可限制致死率。表明體內的炎癥環境以某種方式影響RIPK1細胞死亡檢查點。細胞毒性源于多種細胞因子的共同感應，而這些因子是由炎癥環境提供的。TWEAK和CD40L在炎癥性腸病（IBD）和類風濕性關節炎中上調，這是兩種由TNF驅動的人類疾病，RIPK1抑制劑對其可能是有希望的。
TNF與TNFR2的結合也激活了非經典的NF-κB途徑。因此，TNFR1和TNFR2對TNF的共同感應也有可能將TNFR1的反應從生存轉向RIPK1激酶活性依賴的死亡。因此，有可能體外細胞毒性反應和體內對TNF的細胞毒性反應之間的部分差異源于TNFR2表達水平的不同，或者膜結合的TNF與可溶性TNF的表達不同，因為后者激活TNFR2的能力相對較差。除了TNF家族的配體外，最近還報道了TNF和γ干擾素的共同感應，通過激活JAK-STAT1-IRF1軸，誘導RIPK1激酶活性依賴的細胞死亡（細胞凋亡、熱凋亡和壞死）。在SARS-CoV-2感染期間，TNF和γ干擾素的中和抗體組合被證明可以保護小鼠免于死亡，這一發現支持所報道的嚴重COVID-19期間高溫炎癥的致病作用。
直接或間接地使TNFR1途徑內的一些細胞死亡檢查點失活的突變也足以引起小鼠和人類的炎癥性疾病（表1和2）。影響泛素信號正確調節的突變可以引發TNF介導的異常細胞死亡，并導致炎癥性疾病。例如，cIAP1和cIAP2的缺失就屬于這種情況，它導致了TNFR1信號傳導引起的胚胎死亡。進一步的研究表明，成年小鼠中cIAP1和cIAP2的缺失會導致炎癥和死亡，因為它釋放了對caspase 8依賴性細胞死亡的剎車。泛素連接酶X-linked抑制凋亡蛋白（XIAP）的缺乏是X-linked淋巴增生綜合征的原因，這是一種嚴重的炎癥性疾病。通過使用基因靶向小鼠，XIAP被證明可以通過調節RIPK1的泛素化來防止TNF和RIPK3依賴的細胞死亡，這可能解釋了X連鎖淋巴增生綜合征患者的高炎癥。
LUBAC-和OTULIN-缺陷小鼠的表型支持了線性泛素鏈保護細胞死亡驅動的炎癥這一概念。在所謂的Cpdm小鼠中，Sharpin的突變導致慢性增殖性皮炎，其特點是皮膚炎癥病變、多器官炎癥和免疫系統失調，這完全是由TNF介導的RIPK1激酶活性依賴的細胞死亡引起的。缺乏RIPK3或MLKL的Cpdm小鼠顯示皮炎的發病時間延遲，多器官病變僅有部分改善，這表明壞死作用對該表型有貢獻。然而，FADD的表皮缺失與RIPK3的缺失一起完全阻止了角質細胞的死亡和皮膚炎癥，MyD88的遺傳消融或通過抗生素耗盡微生物群可以挽救Cpdm小鼠的皮膚炎癥，表明角質細胞的死亡會影響屏障的完整性，并通過感知已突破屏障的微生物的病原體相關分子模式而誘發皮膚炎癥性疾病。對組織特異性LUBAC和OTULIN缺陷小鼠的研究進一步證實TNF和RIPK1激酶活性介導的細胞死亡是炎癥病理的驅動因素。在人類中已經發現了HOIP、HOIL1和OTULIN的同型功能缺失的突變。這些突變是罕見的，引起新生兒潛在的致命的多器官自體炎癥。大多數OTULIN相關的自體炎癥綜合征（ORAS；也稱為耳聾）患者用TNF阻斷劑成功治療，確定TNF是自體炎癥的主要驅動因素。RIPK1在抑制細胞死亡和隨后的炎癥方面有關鍵作用。小鼠IECs中RIPK1的缺失會誘發TNF介導的IEC凋亡引起的嚴重病變。雖然RIPK1通過作為NEMO招募的泛素化底物對NF-κB依賴性檢查點做出了貢獻，但體外研究表明RIPK1通過TNF途徑中另一個有待發現的細胞死亡檢查點發揮了更突出的抗凋亡作用。RIPK1缺乏的患者會出現炎癥性疾病，包括IBD。
5. 展望:細胞死亡阻斷藥物
實驗研究已經證明了異常細胞死亡可能誘發炎癥性疾病發展，但要確定促炎癥細胞死亡對人類疾病發病機制的重要性，還需要使用特定抑制劑進行功能驗證。RIPK1和RIPK3抑制劑以及GSDMD抑制劑目前正在調查中，作為人類炎癥性疾病的潛在療法。這類抑制劑可能成為自身免疫性疾病患者的替代治療方法，特別是對那些對抗TNF治療沒有反應或出現不良反應的患者。RIPK1有一個獨特的疏水口袋，可以異生調節其激酶活性，這使得開發對接該口袋的小分子激酶抑制劑成為可能。其中一些RIPK1靶向化合物已進入臨床試驗，用于治療炎癥性疾病，如潰瘍性結腸炎、銀屑病和類風濕性關節炎。另外，血腦屏障滲透型RIPK1抑制劑已經進入臨床試驗，用于治療神經退行性疾病，包括肌萎縮性脊髓側索硬化癥、阿爾茨海默病和多發性硬化癥。TNF誘導的細胞死亡對RIPK1酶活性的要求在小鼠和人類之間也可能不同，這就提出了RIPK1激酶活性的確切功能這一重要問題，因為除了RIPK1之外，迄今為止還沒有發現任何致命的底物。TNF可以觸發caspase 8依賴性的GSDMD裂解。自從發現GSDMD是熱病的中心媒介以來，GSDMD的抑制已被提議作為一種新的治療策略，以防止不同疾病中的炎癥病理。雙硫侖（Antabuse）是美國食品和藥物管理局（FDA）批準的用于治療酒精成癮的藥物，被證明可以抑制人類和小鼠細胞中的焦化作用和炎癥細胞因子的分泌，以及LPS誘導的敗血癥休克和多發性硬化癥的小鼠模型。目前可用的三種GSDMD抑制劑（雙硫侖、壞死磺酰胺和富馬酸二甲酯）都是共價修飾反應性半胱氨酸，因此不是特異性的，需要發現GSDMD的特定小分子抑制劑。由于二次壞死-變態反應也可以通過caspase 3介導的GSDME的裂解和通過caspase 8介導的GSDMC的裂解來誘導，因此需要考慮其他GSDM抑制劑。最近的一項研究顯示，質膜破裂是熱凋亡和壞死細胞死亡的一個共同特征，但也發生在沒有被及時吞噬和清除的凋亡細胞的二次壞死過程中，是由ninjurin 1積極調節和介導的。小鼠的臨床前研究也表明，不同的細胞死亡信號通路不是孤立運作的，而是高度相互關聯的，因此對一個模塊的干預可能無法提供保護，而是可能涉及一個備用的細胞死亡通路。細胞死亡途徑之間的這種密切串擾最終可能會影響到單一抑制性藥物的使用，可能需要多種藥物同時抑制多個細胞死亡模塊或針對中央信號樞紐。
三. 總結
這篇綜述介紹了TNF誘導細胞死亡的分子機制，然后分別從多個不同的角度討論了TNF誘導細胞死亡的過程，作者的觀點涉及到TNF在病原體防御，炎癥性疾病，以及細胞死亡阻斷藥物治療中的重要角色，為我們的研究提供了最新的視角。
參考文獻
van Loo G, Bertrand MJM. Death by TNF: a road to inflammation. Nat Rev Immunol. 2022 Nov 15:1–15. doi: 10.1038/s41577-022-00792-3 .
