掃碼聯系客服
Oncogene|干濕結合又能蹭熱點，就這么干！
哈嘍，大家好，好久不見~往期呢，小編總是喜歡分享一些高分的純生信分析文章，因為小編覺得咱們不用花費高昂的實驗費用，就能發表高分的文章，靠手藝吃飯，何樂而不為呢？（其實是因為小編實在囊中羞澀，又沒有大佬支持做實驗，不得已而為之啊，流了一把辛酸淚）。不過話說回來呢，生信分析是工具，如果能夠借助生信分析發現值得深入研究的科學問題，再進行基礎實驗驗證，就是我們所說的“干濕結合”啦！文章的含金量妥妥上升n個檔次！今天分享的就是一篇今年11月16日發表在Oncogene(IF:9.867)雜志上的非常經典的“干濕結合”文章《Smoking-associated upregulation of CBX3 suppresses ARHGAP24 expression to activate Rac1 signaling and promote tumor progression in lung adenocarcinoma》，一起欣賞吧~
數據來源
1）TCGA：https://portal.gdc.cancer.gov/
2）GEO：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
3）CPTAC：https://proteomics.cancer.gov/programs/cptac
4）CancerSEA：http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/
5）hIP-Atlas：https://chip-atlas.org/
實驗技術
1）細胞活力測定：MTS實驗和菌落形成實驗
2）Western Blot：蛋白質印跡分析
3）Co-IP：免疫共沉淀
4）RT-qPCR：實時熒光定量PCR
5）ChIP：染色質免疫沉淀
6）ChIP-qPCR：染色質免疫沉淀-熒光定量PCR
7）IHC：免疫組化分析
8）PLA：鄰位連接測定技術
9）動物模型：異種移植
實驗結果
一、CBX3 在當前吸煙的 LUAD患者中上調，CBX3 過表達預測 LUAD 患者的生存率更差
從分子特征數據庫（MSigDB）中鑒定出參與組蛋白甲基化相關生物過程和信號通路的基因（n=347）（圖1a）。通過單變量Cox回歸分析，在TCGA-LUAD數據集中鑒定出22個基因與LUAD患者的無復發生存期（RFS）相關。重復運行1000次的Lasso-Cox回歸分析進一步表明，CBX3和TAF9是LUAD患者中與RFS相關的兩個關鍵基因（圖1b）。然后，作者結合了TCGA-LUAD和TCGA-LUSC數據集的轉錄組數據，發現在兩個數據集中，當前吸煙組的CBX3表達水平明顯高于既往吸煙組（圖1c），而TAF9并沒有出現這種現象。CBX3的低表達水平主要集中在TCGA-LUAD數據集中的既往吸煙者和從不吸煙者中（圖1d）。Kaplan-Meier生存分析表明，在TCGA-LUAD和GSE68465數據集中，高CBX3表達水平與較差的RFS和總生存期（OS）相關（圖1e-h）。此外，與TCGA-LUAD和CPTAC-LUAD數據集中的腫瘤鄰近組織相比，CBX3在腫瘤組織中顯著上調（圖1i，j）。 同樣地，通過IHC染色，作者發現與肺腺癌（n=59）相比，CBX3在非腫瘤肺組織（n=8）中下調（補充圖1a，b和表S5）。
二、CBX3促進LUAD細胞生長和侵襲
由于LUAD的單細胞序列表明CBX3可以調節細胞周期，增殖，侵襲和轉移（圖2a和補充圖2a），作者進一步探索了CBX3在LUAD細胞中的促癌作用。為此，作者使用兩種不同的短發夾RNA（shRNA）沉默了A549和H1299細胞中的CBX3表達（圖2b，c）。MTS實驗和菌落形成實驗表明，CBX3沉默降低了LUAD細胞的增殖能力（圖2d-f），還抑制了A549和H1299細胞中的細胞侵襲（圖2g）。相反，CBX3過表達增強了LUAD細胞中的細胞增殖和侵襲（圖2h-k，補充圖2b）。此外，在A549細胞中敲低CBX3后，再挽救細胞中CBX3的表達，重新增強了細胞在體外和體內的增殖（圖2l-p，補充圖2c）。總之，這些數據表明CBX3在LUAD中充當癌蛋白。
此外，作者發現CBX3與LUAD吸煙患者之間存在密切關系。接下來，作者研究了CBX3在吸煙相關LUAD中的作用。A549細胞用shControl或shCBX3感染72小時。嘌呤霉素選擇后，將細胞皮下注射到裸鼠體內。通過蛋白質印跡和RT-qPCR分析評估了CBX3的沉默效應（補充圖3a，b）。然后，將每組小鼠隨機分為三個亞組，這些亞組使用或不使用香煙煙霧提取物（CSE）（0.3ml/20g，ip）或尼古丁（0.5mg/kg，ip）處理（補充圖3c）。結果表明CSE和尼古丁促進了shControl組的腫瘤生長（補充圖3d-f）。然而，CBX3的敲低降低了CSE或尼古丁體內治療誘導的腫瘤生長促進作用（補充圖3d-f）。此外，根據每組裸鼠中氨亮氨酸轉移酶（ALT），天冬氨酸轉氨酶（AST），肌酐（CRE）或血尿素氮（BUN）的血清分析，發現通過shRNA轉染敲低CBX3或用CSE或尼古丁對裸鼠的肝臟和腎功能沒有影響（補充圖3g-j）。總之，這些數據表明CBX3在調節吸煙相關的肺腺癌細胞生長中起作用。
三、CBX3 增加了 LUAD 中活性 Rac1 的數量
為了探索CBX3在LUAD中致癌作用的潛在機制，作者對本體組織和單細胞的轉錄組學數據進行了功能富集分析。基因富集分析顯示，CBX3激活了大量組織（TCGA-LUAD和GSE68465）和A459和LC-2/ad單細胞（圖3a-d）。CBX3敲低（GSE173858）后A549細胞的RNA-seq分析證實了CBX3在Rho GTPase信號傳導激活中的作用（圖3e，f），并表明CBX3下調了A549細胞中Rho GTPase信號傳導的幾個負調節因子（圖3g）。一致地，CBX3沉默降低了LUAD細胞中活化的Rac1的水平（圖3h，i）；Rac1被認為是Rho GTPase信號傳導激活的指標。相反，CBX3過表達增加了A549和H1299細胞中的Rac1水平（圖3j，k）。綜上所述，這些數據表明CBX3在上調LUAD細胞中活性Rac1的量方面起著關鍵作用。
四、CBX3 對 LUAD 中ARHGAP24表達呈負性調節
接下來，作者探索了CBX3調節Rac1途徑的分子機制，評估了CBX3水平與Rho GTPase信號傳導調節器之間的相關性。ARHGAP24是TCGA-LUAD，GSE68465和CPTAC-LUAD數據集中唯一與CBX3水平呈負相關的Rho GTPase調節因子（圖4a）。此外，LUAD標本中的ARHGAP24 mRNA和蛋白質水平低于非惡性組織（TCGA-LUAD數據集和CPTAC-LUAD數據集）（圖4b，c）。有趣的是，低ARHGAP24 mRNA水平與LUAD患者的無病生存率和OS差有關（圖4d，e）。
RNA-seq分析表明，在CBX3沉默后，ARHGAP24在A549細胞中上調（圖4f）。此外，在不同的LUAD數據集（TCGA，GSE68465和CPTAC；圖4g-i）。LUAD組織微陣列（包括59名LUAD患者的組織）用于評估CBX3和ARHGAP24的蛋白質水平（圖4j）。根據轉錄組學數據，CBX3蛋白水平與LUAD組織中ARHGAP24蛋白水平呈負相關（圖4k）。這些結果表明，CBX3對LUAD中的ARHGAP24表達呈負調節。
五、CBX3通過抑制LUAD細胞中的ARHGAP24表達間接增加活性Rac1的量
由于ARHGAP24被報道抑制Rac1途徑，作者接下來評估了CBX3是否由于抑制ARHGAP24表達降低了失活率而上調了活性Rac1的水平。CBX3敲低增加了A549和H1299細胞中ARHGAP24的蛋白質和mRNA水平（圖5a，b）。相反，CBX3過表達降低了A549和H1299細胞中的ARHGAP24 mRNA和蛋白質水平（圖5c，d）。使用ChIP-Atlas的分析揭示了ARHGAP24啟動子中的CBX3結合峰（圖5e）。CBX3通過識別組蛋白H3K9三甲基化（H3K9me3）來抑制靶基因的轉錄，并且H3K9me3結合位點與ARHGAP24啟動子區域中的CBX3結合位點重疊（圖5f）。ChIP-qPCR分析顯示，ARHGAP24的啟動子中存在CBX3和H3K9me3（圖5g，h），表明CBX3通過識別ARHGAP24啟動子的甲基化來調節ARHGAP24的表達。此外，與在A549細胞中單獨敲低ARHGAP24相比，ARHGAP24消融細胞中CBX3的過表達沒有進一步提高活性Rac1的水平（圖5i）。ARHGAP24和CBX3的Co-knockdown降低了CBX3沉默能力，從而間接減少Rac1失活（圖5J）并抑制LUAD細胞的體外和體內生長（圖5k-n）。這些數據表明，CBX3下調ARHGAP24從而增加活性Rac1的量并促進LUAD中的腫瘤生長。
六、CBX3與TRIM28，TRIM24或RBBP4結合以調節LUAD細胞中的ARHGAP24表達
蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡分析顯示，CBX3與各種蛋白質相互作用以調節許多細胞過程（圖6a）。在這些蛋白質中，TRIM28，TRIM24和RBBP4與CBX3表現出最密切的關系（圖6a）。有趣的是，免疫共沉淀顯示CBX3與A549和H1299細胞中的TRIM28，TRIM24或RBBP4相互作用（圖6b-e;補充圖4a）。此外，作者進行了鄰位連接測定（PLA）以確認A549細胞中CBX3與TRIM28，TRIM24或RBBP4之間的相互作用（補充圖4b）。此外，免疫熒光測定顯示CBX3與TRIM28，TRIM24或RBBP4在A549細胞中共定位（補充圖4c）。TRIM28和TRIM24屬于相同的TRIM蛋白質亞家族，含有溴結構域。作者發現缺乏溴結構域的TRIM28突變體無法與A549細胞中的CBX3結合（補充圖5a），這表明CBX3可能通過其溴結構域與TRIM28相互作用。由于溴結構域識別二乙酰化蛋白，作者分析了CBX3的氨基酸序列，并確定了用于乙酰化的共識FBP1或TWIST1基序（補充圖5b）。 與野生型CBX3相比，CBX3 K81R/K84R（KR）突變體的表達降低了CBX3和TRIM28之間的相互作用（補充圖5c），并進一步下調了ARHGAP24（補充圖5d-f）。另一方面，TRIM28、TRIM24和RBBP4的敲低增加了ARHGAP24表達（圖6f-k;補充圖5g-i）。此外，作者發現LUAD樣本中ARHGAP24與TRIM28，TRIM24或RBBP4的水平呈負相關（補充圖5j-l）。缺乏溴結構域的TRIM28突變體的表達不影響ARHGAP24在A549細胞中的表達水平（補充圖5m）。文獻報道RBBP4與PRC組分一起催化組蛋白H3的三甲基化。因此，作者評估了CBX3是否可以結合TRIM28，TRIM24和RBBP4來調節ARHGAP24表達。對ChIP-seq數據的分析顯示，ARHGAP24的啟動子中存在TRIM28，RBBP4，TRIM24，CBX3和H3K9me3的共同結合區域（補充圖6a）。ChIP-qPCR分析證實了TRIM28，TRIM24和RBBP4與A549和H1299細胞中ARHGAP24啟動子的結合（圖6l-n;補充圖6b-d）。此外，TRIM28、TRIM24或RBBP4的敲低降低了CBX3與A549細胞中ARHGAP24啟動子的結合（圖6o-q）。相反，是野生型TRIM28而不是缺乏溴結構域的TRIM28的過表達增強了CBX3與ARHGAP24啟動子的結合（補充圖6e）。此外，在A549細胞中共敲低CBX3之后，由過表達或TRIM28誘導的ARHGAP24表達水平的降低以及由TRIM28，TRIM24或RBBP4的敲低引起的ARHGAP24表達水平的上調并不明顯（圖6r-t;補充圖6f-j）。此外，作者還發現，TRIM24或RBBP4的敲低與TRIM28沉默相結合，不能進一步明顯增強ARHGAP24在A549細胞中的表達（補充圖6k-p），這表明TRIM28是調節ARHGAP24表達的最重要因素。綜上所述，這些數據表明CBX3與TRIM28，TRIM24或RBBP4形成復合物以調節LUAD中的ARHGAP24表達。
總結
在這項研究中，通過對參與組蛋白甲基化的基因進行分析，作者發現組蛋白H3K9甲基化閱讀器CBX3的表達在當前使用LUAD的吸煙者中上調。還確定了CBX3是LUAD進展的關鍵介質。作者對公開可用數據集的生物信息學分析和來自LUAD細胞的RNA-seq數據表明，CBX3調節LUAD細胞中的Rho GTPase信號通路。還發現，CBX3與RBBP4，TRIM28和TRIM24聯合，抑制ARHGAP24的表達，從而上調活性Rac1的量，最終促進肺腺癌的進展。盡管如此，這三種蛋白質如何與CBX3復合物調節LUAD進展的具體機制仍然未知。
總之，作者的研究結果表明，CBX3在當前吸煙的LUAD患者中上調。CBX3過表達促進LUAD細胞增殖和侵襲，并導致LUAD患者的生存結局較差。CBX3的這種致癌作用通過ARHGAP24 / Rac1途徑介導。數據還表明，TRIM28，TRIM24和RBBP4調節LUAD中的CBX3 / ARHGAP24軸（圖7）。這些發現強烈表明，CBX3 / ARHGAP24 / Rac1軸在吸煙誘導的LUAD中起關鍵作用。
參考文獻：
Jin X, Zhang B, Zhang H, Yu H. Smoking-associated upregulation of CBX3 suppresses ARHGAP24 expression to activate Rac1 signaling and promote tumor progression in lung adenocarcinoma. Oncogene. 2021 Nov 16. doi: 10.1038/s41388-021-02114-8. Epub ahead of print. PMID: 34785774.
