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今天給大家分享一篇華西醫院乳腺臨床研究中心劉小偉團隊2023年1月26日發表在Cancer Cell（IF:38.585）上的文章：Immune checkpoint HLA-E:CD94-NKG2A mediates evasion of circulating tumor cells from NK cell surveillance。文章主要介紹了人胰腺導管腺癌循環腫瘤細胞（Circulating tumor cells，CTCs）和自然殺傷細胞（NK）通過免疫檢查點分子與HLA-E: CD94-NKG2A相互作用介導腫瘤細胞免疫逃逸。
一．研究背景以及研究方法
目前，在實體腫瘤的原發或轉移小生境中，腫瘤細胞與不同類型的免疫細胞之間的免疫檢查點分子對已經得到了廣泛的研究。然而，對循環中腫瘤細胞的免疫監測研究較少。由于血液循環是腫瘤從原始位點向遠處器官轉移的主要途徑，對血液中腫瘤細胞與免疫細胞相互作用的研究可能提供一種通過激活宿主免疫消除系統來阻斷轉移的策略。作者團隊主要研究（1）在循環中移動的腫瘤細胞是否會受到免疫細胞的攻擊;（2）哪種類型的免疫細胞具有免疫消除功能;（3）循環腫瘤細胞（circulating tumor cell, CTC）如何通過抑制免疫檢查點對逃脫這種免疫監視。
借助單細胞轉錄組技術，研究者在單細胞精度上描繪了人胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）的CTC、原發性和轉移性病變的轉錄組圖譜。體外和體內的細胞相互作用分析和功能實驗研究結果表明，CTC和自然殺傷細胞(NK)通過免疫檢查點分子對HLA-E:CD94-NKG2A相互作用介導免疫逃逸。通過阻斷NKG2A或抑制HLA-E表達來破壞這種相互作用可以增強NK細胞介導的體外腫瘤細胞殺傷，并在體內防止腫瘤轉移。機制研究表明，血小板源性RGS18通過AKT-GSK3β-CREB信號通路促進HLA-E表達，RGS18過表達促進胰腺腫瘤肝轉移。總而言之，血小板來源的RGS18通過參與免疫檢查點HLA-E:CD94-NKG2A協助CTC逃脫NK介導的免疫監測。免疫檢查點HLA-E:CD94-NKG2A信號的阻斷可以通過免疫殺傷消除CTC進而來防止體內腫瘤轉移。
二．研究結果
1、PDAC 中CTC、原發灶和轉移灶的單細胞轉錄組圖譜
通過10X單細胞組學技術獲得原發和轉移性腫瘤活檢以及CTC的單細胞轉錄組圖譜(圖1A)。嚴格質控之后，共獲得74,206個單細胞轉錄組，其中27,296個細胞來自原發腫瘤，36,922個細胞來自肝轉移瘤，9,988個細胞來自HPV血液(圖1B和1C)。
作者結合單細胞RNA測序 (scRNA-seq) 數據以及經典標記基因并定義細胞群PTPRC- (CD45-) 細胞定義為上皮細胞 (EPCAM+，KRT8+， KRT18+，KRT19+)，成纖維細胞 (FAP+，COL1A1+，DCN+)，內皮細胞(VWF+，CDH5+，ENG+，PECAM1+)。PTPRC+ (CD45+) 細胞進一步定義為B細胞 (CD79A+，CD79B+，MS4A1+)，髓系細胞 (AIF1+，CD14+，LYZ+，FPR1+)， NK細胞 (KLRF1+，KLRD1+，GNLY+) 和T細胞(CD3D+，CD3E+，CD3G+)。CTC由標記基因 (PTPRC-，PPBP+，PF4+，CD9+，KRT8+，TIMP1+)，以及采用CopyKT算法進行拷貝數變異(CNV)驗證(圖1C)。經過嚴格篩選，共鑒定出523個CTC。
2. CTC、原發灶和轉移灶腫瘤細胞的轉錄特征
差異基因表達分析顯示大量血小板相關基因在CTC中顯著富集，而在原發灶與轉移灶的腫瘤細胞中不富集 (圖1D)。有趣的是，CTC中過表達最多的100個基因中，有32個被鑒定為血小板相關基因。作為典型特征，在CTC中觀察到EMT相關基因上調和上皮基因丟失 (圖1D)。此外，GPCR家族基因RGS18、NRGN、GNG11、CCL5等在CTC中表達顯著上調，而核糖體相關基因表達顯著下調。
CluGO生物學通路分析結果表明CTC特異性上調了一些通路，包括免疫相關、血小板相關、致癌、細胞周期、凋亡、代謝、EMT、RNA和生物合成等信號通路 (圖1E)。更重要的是，與原發和轉移性腫瘤相比，CTC中的免疫相關特征更活躍，這意味著CTC與循環中的免疫細胞之間可能存在潛在的相互作用(圖1E)。這種相互作用反映了來自宿主免疫系統的監視和CTC的免疫逃逸，很大程度上決定了CTC在轉移過程中的命運。
(A) PDAC轉移機制研究的實驗方案
(B) t-SNE圖展示所注釋的細胞類型 (n = 18個樣本，74,206個細胞)
(C) t-SNE圖分別顯示原發腫瘤、血液和轉移灶腫瘤的細胞類型
(D) CTC與腫瘤細胞之間差異表達的30個上調/下調基因
(E) CTC和原發性/轉移性病變腫瘤細胞之間差異富集的信號通路
3. PDAC轉移過程中的免疫監測
為了描述CTC的特異性免疫逃逸相關行為，作者對所有CD45+ 免疫細胞進行了細分亞群分析 (圖2A和2B)。根據典型標記物，免疫細胞可進一步分為8種淋巴細胞亞型，包括NK細胞 (KLRD1+，KLRF1+)，NK-T細胞(CD3D+，CD3E+，KLRD1+，KLRF1+)，CD8耗竭T細胞 (CD8A+， PDCD1+，LAG3+)，CD8效應T細胞 (CD8A+，IFNG+，GZMA+)，記憶T細胞(CD3D+，CD44+，IL7R+，LTB+)，na?ve T細胞(CD3D+，CCR7+，TCF7+，SELL+，LEF1+)，Treg細胞(FOXP3+，IL2RA+) 和B細胞(CD79A+， CD79B+)。此外還包括七個髓系細胞亞型，即中性粒細胞 (CD14-，FCGR3B+，FPR1+)，單核細胞 (CD14+，S100A12+，FCGR3A+)，M1型巨噬細胞 (FCGR3A+， CD68+，ITGAX+，ITGAM+)，M2型巨噬細胞 (CD163+，MRC1+，MSR1+)，經典樹突狀細胞 (cDC; CD1C+，FCER1A+，CLEC10A+)，漿細胞樣樹突狀細胞 (pDC; LILRA4+，IL3RA+)和肥大細胞(MS4A2+，TPSAB1+，KIT+) (圖2C)。
作者用CellPhoneDB研究了腫瘤細胞表面配體-受體對和各亞型免疫細胞的分子相互作用。在原發灶、循環擴散階段和轉移灶中，發現了不同的免疫相關配體-受體對，這意味著腫瘤轉移過程中免疫監測的動態變化(圖2D-2F)。在原發/轉移病灶的微環境中，腫瘤細胞與多種類型的免疫細胞如CD8+ T細胞、巨噬細胞、NK細胞等之間存在復雜而密集的相互作用，而腫瘤-免疫在血液循環中的相互作用相對簡單，主要觀察到CTCs和NK細胞之間具有較強的相互作用(圖2E)。
隨后，對免疫檢查點的配受體對進行表征，結果發現原發病灶和轉移灶中相互作用的分子對具有相當大的相似性(圖2G)。在原發性和轉移性病變中，腫瘤細胞和耗竭T細胞之間發現了強烈的共抑制或共刺激相互作用，例如LAGLS9-HAVCR2、TIGIT-PVR和TIGIT-NECTIN2/3，這意味著PDAC可能是一種潛在的免疫治療策略(圖2G)。
值得注意的是，在循環中的CTC和免疫細胞之間觀察到一種獨特的免疫檢查點分子對模式(圖2G)。在這些相互作用的分子對中，HLA-E和CD94-NKG2s被認為是CTC和NK細胞之間最強烈的免疫相互作用，在正向(NK→CTC:CD94-NKG2A:HLA-E, CD94-NKG2C:HLA-E, CD94-NKG2E:HLA-E)和反向(CTC→NK:HLA-E:KLRC1, HLA-E:KLRC2, HLA-E:KLRK1)。進一步解析表明，NKG2A、NKG2C、NKG2D和NKG2E都可能介導這種相互作用。先前的研究表明，CD94-NKG2A異源二聚體作為一種抑制性免疫檢查點分子，比其他NKG2亞型發揮主要作用。當NKG2A水平較高時，NKG2C-E的功能可能被抑制。并且觀察到，HLA-E在CTC上的表達水平高于實體病變腫瘤細胞(圖2H-2J)。因此，NKG2A和HLA-E之間的相互作用上調可能是由HLA-E分子水平的增加引起的。CTCs上HLA-E的上調和NK細胞上CD94-NKG2A的特異性表達模式為它們的相互作用提供了基礎(圖2K)。
(A) t-SNE圖展示所有免疫細胞亞型組成
(B) t-SNE圖顯示所有免疫細胞的組織來源
(C)熱圖展示各亞型免疫細胞中標記基因的表達
(D-F) 原發腫瘤(D)、血液 (E)和轉移腫瘤(F)中腫瘤細胞/ CTC和免疫細胞之間相互作用
(G)腫瘤細胞/ CTC與免疫細胞之間的免疫檢查點相關配體-受體對
(H-J) HLA-E在CTC和腫瘤細胞上的相對表達水平
(K) CD94(KLRD1)和NKG2A(KLRC1)在血液免疫細胞中的相對表達水平
(L)多重免疫熒光驗證血液中相互作用的CTC細胞與NK細胞
4. CTC通過免疫檢查點HLA-E:CD94-NKG2A逃避NK細胞的監測
NK細胞毒性試驗結果表明HLA-E的過表達可以保護PDAC SU86.86細胞免受NK細胞的殺傷(圖3A)。使用特異性抗體單抗阻斷NKG2A可在HLA-E過表達存在或不存在的情況下增強NK細胞的殺傷能力。類似地，抑制PDAC的HLA-E表達可有效地提高NK細胞殺傷性。Western blot結果顯示，典型的免疫檢查點信號SHP-1被抑制，而功能酶GZMB在與HLA-E缺陷腫瘤細胞共培養系統分離的NK細胞中上調(圖3B)。
為了在體內驗證這種免疫檢查點功能，作者通過動物模型實驗驗證(圖3C)，結果表明，抗NKG2A阻斷抗體能夠抑制腫瘤轉移，且具有時間依賴性(圖3D和3E)。越早阻斷NKG2A，越能有效預防轉移。在接種腫瘤前阻斷NKG2A可顯著防止腫瘤轉移，而在0天和1天啟動的阻斷僅部分阻礙腫瘤轉移。第3天(第3和第5天)后，NKG2A阻斷不再能阻止轉移。通過腫瘤淋巴結計數和H&E染色進一步驗證結果(圖3F-3H)。
與NKG2A抗體阻斷的結果一致，生物熒光定量、腫瘤淋巴結計數、H&E染色病結果均顯示H2-T23 (HLA-E)下調可明顯緩解肺轉移(圖3I-3M)。為了驗證這一免疫檢查點分子對的魯棒性，作者通過讓具有免疫功能的小鼠C57/BL6作為受體來重復功能驗證(圖3N)。通過定量評估接種后15天熒光素酶陽性轉移，作者發現NKG2A阻斷和H2-T23下調平均分別減輕了63倍和115倍的肺轉移的形態學和病理學分析肺解剖結果顯示，與空白載體的對照組相比，NKG2A阻斷和H2-T23下調明顯減輕了轉移。這些結果進一步證實了HLA-E:CD94-NKG2A在血液循環轉移過程中的免疫檢查點功能。在另一個獨立隊列中，Kaplan-Meier估計結果顯示，阻斷NKG2A和抑制H2-T23均可顯著提高肺轉移小鼠在接種腫瘤后27天的總生存率(圖3O)。
(A)評估NK細胞對PDAC SU86.86細胞的細胞毒性
(B)檢測NK細胞的細胞毒效應酶GZMB和免疫檢查點相關激酶SHP1
(C)Balb/c裸鼠靜脈接種KPC-Luc細胞，并在指定時間點(-1、0、1、3和5天)開始NKG2A阻斷治療
(D和E)在靜脈接種KPC-Luc細胞15天后，通過生物發光成像系統觀察(D)和定量(E)肺轉移
(F和G)對肺內轉移瘤結節進行拍照(F)和定量(G)
(H)用H&E染色評估 (D)的肺病理結果
(I-L)注射H2-T23敲除KPC-Luc細胞的Balb/c裸鼠肺轉移的生物發光圖像(I)和定量(J)。計數肺腫瘤中腫瘤結節數(K)，顯示代表性圖像(L)
(M)用H&E染色評估(I)肺的肺病理結果
(N)在靜脈接種KPC-Luc細胞15天后，使用生物發光成像系統觀察轉移到肺的KPC-Luc細胞。C57BL/6小鼠接種前1天用抗NKG2A抗體阻斷或靜脈移植H2-T23 (HLA-E)敲除的KPC-Luc細胞
(O) Kaplan-Meier圖顯示KPC-Luc細胞接種小鼠經指示治療后的總生存率
5. RGS18通過AKT-GSK3β-CREB1軸上調CTC上的HLA-E
為了闡明CTC調節HLA-E表達的具體機制，作者評估了與HLA-E表達水平潛在正相關的差異表達基因 (圖2H)。作者團隊篩選出一系列HLA-E相關基因，包括PPBP、PF4、NRGN 和RGS18等(圖4A)。將這些基因導入兩種PDAC細胞系SU86.86和CFPAC-1后，HLA-E表達水平上調。其中RGS18最強(圖4B)。為了驗證RGS18在CTC中的上調，作者通過免疫熒光染色檢測了所有6例接受scRNA-seq的患者活檢組織中的RGS18蛋白。RGS18幾乎只在CTC中表達，而不是在原發和轉移灶的腫瘤細胞中表達(圖4C)。
然后，作者探討了RGS18對HLA-E表達的調節。作為R4亞家族蛋白，RGS18通過Gαi和Gαq負調控GPCR信號通路。通過Western blot實驗檢測了RGS18過表達的PDAC細胞中潛在的下游通路。通過檢測關鍵激酶的磷酸化，作者發現AKT通路被RGS18過表達特異性地干擾(圖4D)。
RGS18上調后，AKT磷酸化下調。隨后，GSK3β通過抑制絲氨酸殘基9磷酸化而穩定(圖4D)。然后GSK3β通過磷酸化絲氨酸殘基129來增強CREB1的活性。被激活的CREB1顯示出細胞核優先亞細胞定位模式(圖4E)。在細胞核中，CREB1與RFX和NFY形成轉錄正調控復合物，結合HLA-E的啟動子結構，該結構由完整的SXY模塊和不完整的增強子A和ISRE位點組成。結果顯示RGS18過表達上調了三種PDAC細胞系中HLA-E的水平(圖4D)。與這些結果一致，CREB1的下調顯著下調HLA-E的表達(圖4F)。相反，在SU86.86和CFPAC-1細胞中敲除RGS18可增強AKT的磷酸化并破壞GSK3β的穩定。隨后，它使CREB1失活并下調HLA-E表達(圖4D)。此外，通過兩個活化突變體AKTE17K和AKTQ79K在PDAC細胞中激活AKT信號，抑制GSK3β，下調CREB1，進而降低HLA-E的表達(圖4G)。綜上所述，信號通路研究表明RGS18通過AKT- GSK3β-CREB1軸促進HLA-E的表達。
為了驗證RGS18的促轉移功能，作者通過脾內注射熒光素酶標記的SU86.86 PDAC細胞和人NK細胞，總結了HPV肝轉移的過程(圖5A)。生物發光圖像和信號定量顯示，在接種過表達RGS18的SU86.86細胞的小鼠中，肝轉移主要發生在肝臟的解剖位置(圖5B和5C)。相反，空白載體SU86.86細胞接種對照組小鼠，未見明顯肝轉移。通過檢查解剖的肝臟器官，作者在接種了人RGS18 (hRGS18)過表達PDAC細胞的小鼠中發現了嚴重的轉移性腫瘤，而在對照組中沒有發現(圖5D)。H&E染色和免疫組化檢測EpCAM和RGS18進一步證實了這一結果(圖5E)。在另一項獨立實驗中，RGS18過表達顯著降低了肝轉移小鼠的總生存率(圖5F)。
為了進一步驗證RGS18是否通過促進NK細胞的免疫逃逸來促進腫瘤轉移，作者進行了肺轉移模型實驗發現，與肝轉移相似，生物發光成像和信號定量結果顯示mRGS18通過上調H2-T23顯著促進肺轉移(圖5G, 5H)。在腫瘤接種前1天注射4劑NKG2A阻斷抗體可抑制腫瘤轉移。腫瘤淋巴結計數和H&E染色進一步證實了這一結果(圖5I-5K)。綜上所述，這些數據表明RGS18通過上調CTC中抑制性免疫檢查點HLA-E在促進腫瘤轉移中發揮關鍵作用。
(A)三維散點圖顯示CTCs中與HLA-E表達水平相關的差異表達基因
(B)在SU86.86和CFPAC-1中檢測HLA-E表達水平，PPBP、PF4、NRGN或RGS18過表達。
(C)通過多重免疫熒光圖像顯示CTC和患者匹配的原發性/轉移性腫瘤中的RGS18
(D)在SU86.86和CFPAC-1細胞中分別檢測到RGS18過表達(左)或敲低(右)的AKT-GSK3β-CREB通路活性蛋白和HLA-E。
(E)通過免疫熒光染色可見過表達RGS18的PDAC細胞中p-CREB1的亞細胞分布
(F) western blot檢測CREB1敲除的SU86.86和CFPAC-1細胞中HLA-E和CREB1蛋白的表達
(G)在過表達AKTQ79K或AKTE17K突變體的SU86.86中檢測AKT- GSK3β-CREB通路活性和HLA-E水平
(A)解剖圖顯示PDAC肝轉移模型的建立，通過半脾注射SU86.86-Luc細胞
(B和C)接種14天后，使用生物發光成像系統對肝轉移進行可視化(B)和定量(C)。
(D)按(A)所述治療的小鼠中解剖的肝轉移腫瘤
(E)通過H&E和IHC染色人EpCAM和RGS18評估PDAC肝轉移
(F) Kaplan-Meier圖顯示PDAC肝轉移小鼠的總生存期
(G-J)采用小鼠RGS18過表達或不表達的KPC-luc尾靜脈注射建立KPC肺轉移模型。使用生物發光成像系統對肺轉移性KPC腫瘤細胞進行可視化(G)和定量(H)。統計肺內腫瘤結節數(I)，顯示代表性圖像(J)
(K)用H&E染色評價(G)的肺病理結果
6. CTC通過吸收血小板獲得RGS18
眾所周知，CTC通常被血小板覆蓋，血小板是RGS18蛋白的主要來源。除RGS18外，CTC的scRNA-seq數據中還特異性觀察到PPBP、PF4等血小板相關基因 (圖1D)。因此，作者推測CTC中的RGS18可能來源于粘附血小板，通過共聚焦顯微鏡，他們發現血小板不僅在的CTC細胞表面上，而且在CTC細胞中存在(圖6A)。當腫瘤細胞與WGA-Alexa594預先標記的患者來源的血小板孵育時，觀察到腫瘤細胞內部的熒光信號(圖6B)。并且流式細胞術對熒光信號的定量進一步表明，患者來源的血小板被腫瘤細胞以劑量依賴的方式內化(圖6C)。然后，研究人員用小鼠PDAC細胞系KPCs孵育人血小板，并通過特定引物的實時qPCR檢測供體(人)和宿主(小鼠)RGS18的mRNA水平。結果表明，人類RGS18的mRNA以劑量依賴的方式上調，而不是小鼠RGS18(圖6D)。從PDAC患者分離的血小板孵育后，在SU86.86和CFPAC-1中，RGS18和HLA-E水平均以劑量依賴方式上調(圖6E)。綜上所述，結果表明CTC獲得血小板來源的RGS18, RGS18通過AKT- GSK3β-CREB信號通路上調HLA-E的表達(圖7)。上調的HLA-E與NK細胞上的CD94-NKG2A相互作用，作為免疫檢查點對抑制循環中對CTC的免疫監測。
(A)用免疫熒光標記將CTC與血小板標記物共染色
(B)用WGA594預標記PDAC患者血小板的細胞內定位
(C)孵育24 h后，流式細胞術檢測內化WGA594預標記血小板的SU86.86和CFPAC-1細胞
(D) qPCR檢測人RGS18和小鼠RGS18相對mRNA表達量
(E) western blot檢測PDAC患者血小板處理72 h后SU86.86和CFPAC-1細胞中HLA-E、RGS18和CD41蛋白水平
四、總結
在這里，研究者報道了HLA-E和CD94-NKG2A之間的直接相互作用作為一個免疫檢查點，它負向調節NK細胞對CTC的免疫清除。因此，阻斷HLA-E:CD94-NKG2A可以通過激活NK細胞消除CTC的功能來防止腫瘤轉移。值得注意的是，該方案可能對原發性或已經轉移的腫瘤都沒有高療效，因為HLA-E:CD94-NKG2A在實性病變中的表達相對較低(圖2G)。這些結果可能部分解釋了目前單藥抗CD94抗體(NCT02459301, NCT02331875, NCT02557516)臨床試驗中不滿意的結果。此外，在作者納入的所有胰腺癌病例中都觀察到缺乏PD-1:PD-L1相互作用，說明抗PD-1或PD-L1方案在這類惡性腫瘤中的療效較差。作者的結果還表明，阻斷HLA-E:CD94-NKG2A或采用缺乏CD94/NKG2A的CAR-NK細胞可能是預防CTC介導的轉移的有前景的策略，特別是在大量的CTC釋放到血液中的情況下，例如實體瘤的手術切除。
小編認為這是一個研究癌癥轉移機制很好的一個范例，從中找到輔助腫瘤細胞轉移的“幫手”，進而通過阻斷相互作用，達到緩解腫瘤轉移的目的，大家如果感興趣，是不是可以換個癌種試試呢！
