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m6A Regulator-Mediated Methylation Modification Patterns and Characteristics of Immunity in Blood Leukocytes of COVID-19 Patients
文章涉及基礎概念簡述：表觀遺傳學 (Epigenetics) 是與遺傳學 (genetic) 相對應的概念。遺傳學是指基于基因序列改變所致基因表達水平變化，如基因突變、基因雜合丟失和微衛星不穩定等；而表觀遺傳學則是指基于非基因序列改變所致基因表達水平變化，如RNA修飾和染色質構象變化等。
背景1：RNA修飾是RNA分子化學成分的轉錄后改變，具有改變RNA功能的潛能。雖然RNA中已鑒定出100多個不同的變化堿基，但其中大多數局限于非編碼RNA，特別是轉移RNA和核糖體RNA。對于信息RNA，最普遍的內部修飾堿基是N6-甲基腺苷 (m6A)。m6A在調控mRNA表達的機制及其在多種細胞類型（免疫細胞）中的功能重要性已被廣泛研究。
背景2：2020年5月，Ziv Shulman團隊在Nature Immunology雜志上發表題為“The RNA modification N6-methyladenosine as a novel regulator of the immune system”的綜述[1]。總結了m6A在調控免疫的各個方面的功能，包括免疫識別，先天性和適應性免疫反應的激活，以及細胞命運的決定。其中，“m6A調節抗病毒反應”與本文內容背景相關。抑制免疫反應的信號負責誘導快速和有效的抗病毒反應，同時抑制反應的規模和持續時間，以避免隨之而來的毒性。因此，必須嚴格控制先天免疫識別激活的基因表達程序。事實上，m6A對參與抗病毒免疫反應的幾個中心mRNA發揮了關鍵調控作用。有研究表明，病毒感染增強了RNA解旋酶DDX46與編碼抗病毒蛋白MAVS、TRAF3和TRAF6的轉錄本的結合，導致ALKBH5的募集，從而去甲基化這些轉錄本。這種去甲基化反過來導致這些轉錄本保留在細胞核中，降低它們的蛋白水平，從而抑制I型IFN反應的產生。
正文解讀：
文章于2021年9月投稿，2021年12月份發表于Frontiers in Immunology，歷時3個月。研究人群為感染新冠病毒的126個患者，目的探討血液中的白細胞m6A水平與感染新冠病毒后發生的變化，以及對患者預后的影響。下載GEO數據庫中芯片數據（GSE157103），我們發現COVID-19患者血白細胞的m6a修飾水平明顯高于非COVID-19患者，這種差異與CD4 + T細胞有關。通過無監督聚類鑒定出兩個聚類，以T細胞活化為特征的m6a聚類A比m6a聚類b預后更高。代謝水平升高，免疫檢查點阻塞，m6A簇b中m6A評分較低，根據9個篩選出的基因構建保護性模型，對COVID-19具有良好的預測價值。進一步分析發現，保護評分與HFD45、無呼吸機天數呈正相關，與SOFA評分、APACHE-II評分、crp呈負相關。我們的研究系統地描述了SARS-CoV-2感染患者中m6a甲基化修飾與宿主淋巴細胞之間的復雜相關性，并為預測患者的預后提供了一個良好的模型。圖1
結果：
Upregulation of m6A Regulators and Activation of the Immune System in COVID-19 Patients
1.參與調節m6A的20個基因，在感染和未感染新冠病毒的患者之間存在差異表達（箱圖）；2.按m6A甲基化專有分類：readers，writers，erasers將上述基因分類，進行相關性分析（相關性熱圖）；3.根據感染和未感染新冠病毒的患者的芯片測序數據，進行通路差異分析（GSVA），結果顯示兩組之間免疫相關通路激活狀態不同，干擾素途徑顯著存在差異（熱圖）；4.免疫細胞浸潤分析提示感染新冠和未感染新冠病毒患者之間血液的免疫細胞豐度存在差異，并且激活態的CD4記憶T細胞明顯與readers存在相關性。圖2
Patterns of m 6 A Regulators and Biological Function of Each Pattern
對感染新冠患者血液中的m6A的readers，writers，erasers基因進行富集分析：1.首先基于上述20個基因的表達矩陣，通過無監督聚類可以將新冠患者分為兩個亞組；2.感染新冠患者亞組之間這20個基因表達存在差異；3.顯著表達差異的m6A調節基因為CBLL1, HNRNPC, ZC3H13，IGF2BP1, METTL3, RBM15B；4.顯著差異表達的m6A調節基因中METTL3為甲基轉移酶復合體，提示亞組B的m6A甲基化水平更高；5.比較亞組A和亞組B之間，新冠患者預后相關的基因（既往文獻報道）的表達差異情況；6.比較不同亞組之間的住院時間，提示亞組A住院時間更短；7.GSVA通路差異分析提示亞組A，B之間，代謝與免疫通路存在差異活化。圖3
Immune Infiltration and Immune Checkpoint Characteristics in m6A Patterns
亞組A,B免疫浸潤分析提示：1.亞組之間CD8和NK細胞豐度存在差異；2.經典的免疫檢查點兩組存在表達差異；3.根據免疫浸潤評分發現亞組之間存在免疫狀態差異；4.兩組之間差異基因的富集分析提示感染新冠病毒的患者，不同的m6A水平影響患者血液中免疫細胞豐度的改變，以及潛在通過免疫檢查點或代謝等通路影響患者預后。圖4
Construction and Validation of an m6A-Related Protective Model
構建區分兩亞組新冠患者的分子模型：1.亞組A,B的差異基因與新冠非新冠患者之間的差異基因取交集，得到4565個共同差異基因，通過lasso回歸篩選出9個候選基因，構建預測模型；2.通過模型對本研究的患者進行打分，發現高低分組之間臨床指標存在差異（賦予模型臨床意義）；3.用來構建模型的基因的富集分析提示，這些基因參與了與細胞周期，病毒感染等生物過程。圖5-6
總結
作者首先發現m6A甲基化調控的3類基因在感染和未感染新冠患者血液芯片測序數據的表達水平存在差異。免疫浸潤分析發現新冠患者的血液中特殊亞群免疫細胞的豐度存在異常狀態。GSVA分析發現患者與對照組的信號通路存在差異。通過無監督聚類將新冠患者分為兩個亞群，亞群之間存在不同的免疫浸潤、免疫狀態和預后差異。最后，將患者與非患者的差異基因和亞群之間的差異基因取交集，構建預測模型，模型具有良好的診斷效能。
亮點點評
新冠無疑是今年研究熱點，各大期刊也是優先發表的病種。要問生信如何發的快準狠，選擇新冠作為研究的疾病不失為一劑良方；
基于m6A甲基化的免疫調節背景，恰好可以結合生信最具代表性的免疫浸潤分析模塊，不僅可以量化免疫細胞亞型的豐度，還可以利用免疫檢查點、免疫細胞表型（M2極化，MDSC免疫抑制，Treg細胞免疫抑制）等熱點問題豐富結果；3.本文的芯片數據，從臨床信息的完整度來講，質量要高于一般的腫瘤芯片數據，可能也是基于目前疫情的原因，大家極盡所能的想保留患者的臨床信息。
于此，我們不妨再跳躍下思維，感染新冠的腫瘤患者的芯片數據是不是有很多，如果芯片數據存在，我們是不是又可以來一套新冠相關的腫瘤生信分析？通過這篇研究的結果，感染新冠后患者的免疫微環境發生變化，影響腫瘤患者的免疫微環境？進而影響患者的預后。除了m6A，鐵死亡，焦亡，自噬，小眾基因集（TP53基因集、趨化因子基因集、代謝基因集），是否也有不同的結果，又或者結合WGCNA等算法，碰撞不一樣的火花呢？ 想發表新冠的生信文章，一定不要再拖了，打鐵要趁熱呀!
[1]. Shulman, Z. and N. Stern-Ginossar, The RNA modification N6-methyladenosine as a novel regulator of the immune system. Nature Immunology, 2020. 21(5): p. 501-512.
