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近些年，隨著m6A相關研究的井噴式發展，如今大家對m6A修飾早已耳熟能詳。作為mRNA上最常見的一類RNA修飾，其廣泛存在于各類真核生物中；且眾多研究表明m6A幾乎參與調控了RNA加工代謝的各個過程（前體mRNA加工、mRNA表達/翻譯/降解等）。m6A主要受三類蛋白調控：Writers、Erasers和Readers。正常生理狀態下，Writers和Erasers共同調控細胞內總體m6A修飾水平，使其處于動態平衡；而Readers則負責與m6A修飾的RNA特異性結合，影響其轉錄后的命運。
研究證實m6A調控基因（后統稱m6A regulators）的失調與癌癥發生發展密切相關。自2019年第一篇純生信分析整體m6A regulators在泛癌水平的分子/臨床特征以后（PMID：31521193），多個課題組開始以整體m6A regulators為研究對象，按照高度相似的技術路線，在不同癌種中進行相對深入的分析。此類研究全面揭示了m6A regulators在不同癌種中的失調圖譜，解析了其與癌癥相關核心通路及腫瘤微環境（TME）之間的潛在聯系，并利用包括機器學習等在內的一些方法，建立m6A regulators相關的預后指標，為臨床病人的精確分群提供協助。
在“生信人”微信公眾號的歷史推文中，已對多篇代表性的m6A regulators生信分析文章進行過詳細解讀（此處不再列舉），為廣大的臨床/科研工作者提供了切實可行的幫助。2022年以來，編者留意到仍有多篇m6A regulators生信分析文章發表。該篇推文中，編者選取了2019年以來發表的幾篇代表性文章，對其主要結果進行總結，并對值得借鑒的內容予以評論，以拋磚引玉。
文獻一 2019-Cancer Immunology Research-Tumor Microenvironment Characterization in Gastric Cancer Identifies Prognostic and Immunotherapeutically Relevant Gene Signatures
該篇文獻為后續m6A regulator整合分析類文章提供了重要的參考價值，后者將m6A和TME聯合分析也大多受此啟發。文章以CIBERSORT和LM22為出發點，獲取>1000個胃癌樣本（GEO + TCGA）中免疫細胞的相對豐度，利用無監督聚類將樣本分為三類，對應3中不同的TME亞型。隨后，作者著重比較了3個亞型之間腫瘤分期、生存時間、病理診斷等指標的差異，建立TME亞型與后者之間聯系。為了解析其潛在分子機制，作者比較了不同亞型之間轉錄水平的差異，并在此基礎上建立可指示病人預后的TMEscore指標。TMEscore不僅與病人的臨床指標、核心基因突變顯著相關，也可用于預測患者對免疫治療的反應。為了使結果更加可靠，作者還基于ACRG數據庫做了同樣的分析，得到一致結果。目前該篇文獻被引用>300次，文中所有分析均可在后續文章中找到類似內容，足以說明問題。
文獻二 2019-Molecular Cancer- Molecular characterization and clinical relevance of m6A regulators across 33 cancer types
這篇文獻是第一篇m6A regulators在泛癌中整合分析的文章（letter），因此小編在此予以概括，盡管2021年另一團隊也進行了類似的工作且發表在同一雜志上。作者主要進行分析了20個m6A regulators在不同癌種中的突變水平、CNV、表達差異、與hallmark之間的聯系以及預后等內容。文獻主要內容均是以結果為導向的，并無太多生物學意義。即便如此，其中的分析內容也為具體癌種中的分析提供了參考。
文獻三 2020-Molecular Cancer-m6A regulator-mediated methylation modification patterns and tumor microenvironment infiltration characterization in gastric cancer
這篇文獻是目前所發表的影響因子最高的m6A regulators整合分析類文章之一。從文章內容來看，作者借鑒了前兩篇文獻中的分析思路，并在此基礎上進行了大量的細節分析。文章以“m6A genes—m6Acluster—m6A.gene.cluster—m6Ascore”為主要脈絡，主要比較不同亞群之間的hallmark、TME及臨床特征等差異，并解釋了這些分群與病人預后（m6Acluster/m6Ascore）及對免疫治療反應（m6Ascore）相關的潛在分子機制。文中，作者基于免疫細胞的相對豐度將各亞群分為immune-desert/ -inflamed/ -excluded三種，并從這個角度解釋亞群之間的臨床指標差異。此外，作者還花了大量篇幅解析特定基因如KIAA1429與TME及hallmark之間的聯系，具體方法值得借鑒。
文獻四 2021-Molecular Cancer-Identification of tumor antigens and immune subtypes of pancreatic adenocarcinoma for mRNA vaccine development
該篇文獻與m6A regulators并無太大關系，編者在這里進行展示主要出于三個原因：1）文章思路與m6A regulators整合分析類似；2）文章團隊背靠背還有一篇發在了同樣的雜志上，只是換了癌種，讀者可進行對比；3）部分分析內容值得借鑒。文中，作者結合表達/突變/預后等指標，得到1997個immune-related基因，并在此基礎上進行免疫分型（類比m6Acluster）。作者詳細比較了不同亞型之間的臨床特征、免疫marker及TME等指標的差異。最終，通過WGCNA分析落腳到少數基因之后構建gene_score（類比m6Ascore）用以指示病人的預后特征。小編認為文中有以下幾點值得借鑒：1）部分figure比較精美；2）大量免疫相關的marker值得收集，可以結合自身課題講故事；3）通過WGCNA縮小候選基因的方式與其他幾篇文章明顯不同，可以嘗試；4）引入Monocle等高級分析亦可為文章增色。
文獻五 2022-NAR Cancer-A m6Avalue predictive of prostate cancer stemness, tumor immune landscape and immunotherapy response
該篇文獻選自3月底發表在NAR Cancer（NAR新推出的期刊，主要發表核酸研究和癌癥研究交叉領域的文章，暫無影響因子）上的一篇文章。文章整體脈絡與文獻三高度相似。此外，作者也進行了一些亮點分析，現予以解讀。亮點一：作者收集整理了m6A2Target數據庫中20個m6A regulators的潛在靶基因，并與不同亞群之間的DEG進行比較，在m6A_C3亞群中上調表達的DEG（vs m6A_C1）相對于下調的DEG，更加傾向于是m6A regulator的潛在靶基因，暗示整體m6A信號通路在m6A_C3亞群中處于相對活躍的狀態。亮點二：選擇性剪接（AS）異常是癌癥的hallmark。該篇文章的團隊2020年在Nature communication 上發表了領域內第一篇PCa發生發展過程中AS的動態變化圖譜，并發現內含子保留事件（IR）可作為治療PCa的潛在靶點。在此，作者比較了3個亞群之間的AS情況，發現在m6A_C3亞群中存在更多的AS事件（尤其是IR）。AS是產生新抗原（neoantigens）的重要途徑之一。分析發現m6A_C3亞群中存在更多的新抗原（但差異不顯著）。抗原識別是免疫反應過程中必不可少的環節。作者利用TRUST4軟件鑒定并比較了不同亞群之間B/T細胞受體的抗原互補決定區域（CDR）數量，發現m6A_C1中CDR1/2/3的數量最多，而m6A_C3中最少。綜上，作者推測m6A_C3亞群中有較多新抗原卻較少免疫受體意味著抗原呈遞功能的缺失。亮點三：作者并未像已有文獻那樣將3個亞群分為immune-desert/ -inflamed/-excluded，而是結合pan-cancer數據將其分為fibrotic/non-fibrotic，并證實fibrotic在PCa中與良好預后相關。在如胃癌（PMID：32164750）、結腸癌（PMID：33500720）中，fibrotic相關通路（EMT1/2/3、TGFb、CAF等）通常與不良預后相關，而glioma（PMID：33594424）和PCa中，該趨勢卻相反，凸顯了癌種異質性。
小編總結
限于篇幅限制，小編僅對上述五篇文獻進行了總結，讀者亦可翻閱原文發掘更多值得借鑒的細節。此處，小編想提一下文獻五，讀完這篇文獻，讓人不由感嘆一聲“卷！”。其文獻內容相較同類文章不能說最多，但絕對不少，且有一些不錯的亮點分析。即便如此，文章只發在了目前尚無影響因子的一個新雜志上（這里并沒有輕視新雜志的含義），和其他已發表的類似文章相比，只能說沒有對比就沒有傷害。
此處，小編匯總了近三年一些關于m6A regulator整合分析的代表性文獻（包括少量分析思路高度類似的其他文獻），便于讀者查閱和比較。總體而言，此類文獻的分析思路均與2019年的那篇文章（PMID：31521193）高度類似，且絕大部分內容也都可以在前文中找到影子，因此后續這種文章的創新性就不那么突出了，很多僅僅是換個癌種又是一篇新文章，這也是小編給后續文章的創新性打分較低的原因。細心的讀者會發現，這些文章中不乏一些發表在一區或者是影響因子較高的雜志上，然而他們的內容或者創新性卻并不突出，更何況發表好文章對創新性要求很高，反而對工作量要求比較低。這里邊有沒有團隊聲望的原因？亦或雜志編委職位的原因？留給讀者思考。
回到前文介紹的幾篇文章，讀者可以發現文中的一些亮點分析可以借鑒，比如AS、pan-cancer已有分型等，讀者亦可以結合自己課題的屬性，重點關注少數通路的變化，講好自己的生物學故事。然而即便如此，此類型文章自帶硬傷。首先，絕大部分分析均沒有實驗數據支撐（也沒辦法驗證），分析思路高度雷同，創新性很低，絕大多數團隊follow這種思路進行的分析很難發在優質的雜志上。而且，這種換幾個基因或者癌種就出一篇分析文章的套路，容易讓編輯或同行產生不好的印象。其次，目前關于m6A regulator的整合分析都主要停留在基因表達層面，而作為一種mRNA修飾，m6A-seq必不可少，因此目前所有分析都有種“到皮不到肉”的缺陷，并不能揭示真正的m6A修飾圖譜。而短期內，類似TCGA這種國際性的m6A-seq極難實現，因此很長一段時間內，此類分析都無法真正解決這個問題。值得一提的是，NAR cancer這篇文章中結合m6A2Target數據庫的分析值得大家借鑒，且文中還用到了少許病人m6A-seq的結果（盡管數據尚未公開，但給有基因列表）。再次，小編上述匯總的文獻中，絕大部分最后都建立了一個基于m6A regulator的評分指標，盡管這些指標與病人預后、免疫治療反應等相關，但在實際臨床應用中，很難將這些指標應用到少數病人的診治當中。
回歸實際情況，面對畢業、晉升、考核等諸多場景，大家確實有實實在在的難題，不可能都去追求優質頂刊，或是指望在臨床應用中有什么作用，此時參考加模仿或許可以作為緩解此類壓力的一種途徑。這大概是所有學科中“學問-現實”的巨大gap吧！
