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大家好！今天給大家分享的文獻是2022年1月發表在Cancer Cell（IF=31.74）上的文章。前期基因組和轉錄組測序已揭示肝內膽管癌的遺傳圖譜，多組學的發展，包括蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學結合基因組學，闡明了新的疾病亞型和信號通路，并發現了癌癥治療的潛在靶點，這種多組學策略可能有助于揭示新的機制和確定新的靶點，為肝內膽管癌患者提供額外的治療選擇。這篇文章就是蛋白質基因組學水平上確定了肝內膽管癌的新亞型。
Proteogenomic characterization identifies clinically relevant subgroups of intrahepatic cholangiocarcinoma
蛋白基因組學的特征確定了肝內膽管癌的臨床相關亞群
文章思路：
摘要圖片
摘要：作者利用262例患者配對的腫瘤和鄰近肝組織對肝內膽管癌（iCCA）進行了蛋白基因組學測定。整合的蛋白基因組學分析優先分析了遺傳變異并揭示了iCCA發病機制。黃曲霉毒素特征與腫瘤發生、增殖和免疫抑制有關。突變相關信號特征顯示TP53和KRAS共突變可能通過整合素-FAK-SRC通路促進iCCA轉移。FGFR2融合激活Rho GTPase通路并可能是新生抗原的潛在來源。蛋白基因組學分析識別出4個亞群（S1-S4），并具有特異性的生物標志物。這些亞群在預后、基因變異、微環境失調、腫瘤微生物組成和潛在治療方面具有顯著特征。SLC16A3和HKDC1被進一步鑒定為與iCCA細胞代謝重編程相關的潛在預后生物標志物。本研究為進一步確定iCCA的分子發病機制和治療機會提供了寶貴資源。
結果：
1.中國人群iCCA的蛋白基因組學圖譜
作者對262例iCCA患者的遺傳譜和相關臨床病理特征進行了分析（圖1A）。最終確定了復旦大學人群（FU-iCCA）、MSKCC和ICGC中8個顯著突變的基因突變頻率（圖1B）。FU-iCCA人群與其他已發表的iCCA人群之間的突變特征進行比較時發現黃曲霉毒素特征在7.1% FU-iCCA人群和9.7%的Zou等人的研究中存在，這兩組研究對象均為中國人群，但在三個西方人群中均不存在。馬兜鈴酸（AA）也有這種類似的趨勢（圖1C）。比較有明顯黃曲霉毒素特征、馬兜鈴酸特征和其他特征的iCCA人群腫瘤TMB和腫瘤新抗原時發現黃曲霉毒素和AA特征的樣本TMB和新抗原載量顯著升高（圖1D）。通過比較所有具有或不具有黃曲霉毒素特征的腫瘤的多組學數據，發現具有黃曲霉毒素特征的腫瘤表現出DNA修復和細胞周期通路上調，凋亡、感染炎癥和免疫通路下調（圖1E）。進一步分析發現，TP53突變，尤其是R249S突變與黃曲霉毒素特征顯著相關（圖1F和1G）。
圖1 FU-iCCA人群基因組圖譜
2.體細胞拷貝數變異的多組學分析
拷貝數變異（CNAs）對mRNA、蛋白質和磷酸化蛋白豐度有順式和反式的影響（圖2A）。mRNA、蛋白質和磷酸化蛋白分別觀察到3981、1081和408個顯著的順式相關性，在3個組學中只有194個顯著的順式效應（圖2B）。總共有963個蛋白質同時顯示了CNA-mRNA和CNA-蛋白順式效應，這些效應主要富集在代謝、生物合成和蛋白質加工途徑中（圖2C）。在前10個反式效應的癌癥基因普查（cancer gene census, CGC）中MDM4擴增與免疫治療超進展有關（圖2D）。在染色體1p和14q中，顯示出最多反式效應的基因為CNA-蛋白質和CNA-mRNA（圖2A）。值得注意的是，14q缺失顯示出與全蛋白質組和轉錄組豐度的差異相關（圖2E），提示這些區域可能存在蛋白質水平的調控。對于蛋白質豐度隨14q缺失增加的585個基因，富集分析揭示了它們與剪接體、錯配修復、DNA復制、細胞周期和代謝有關（圖2F）。此外，14q缺失對蛋白質表達有順式和反式的影響，而不是mRNA表達（圖2G）。總之，14q相關的順式和反式的缺失可能為iCCA的腫瘤發生提供機制基礎（圖2H）。
圖2 拷貝數變異對mRNA和蛋白質豐度的影響
3.體細胞驅動基因突變的蛋白質基因組關聯性分析
TP53突變與細胞周期、藥物代謝、吞噬體和碳代謝通路上調有關，也與ECM黏著斑、PI3K-AKT和Hippo-YAP信號通路下調有關（圖3A）。KRAS突變與炎癥-感染和ECM黏著斑信號通路中的蛋白增加有關，與細胞周期中的蛋白減少有關（圖3B）。有趣的是，作者選用的人群中10/215名iCCA患者存在TP53和KRAS共突變，且生存率明顯低于TP53或KRAS單突變患者（圖3C），這表明它們有獨特的分子特征。細胞黏附相關分子ITGA6、ITGB4、ITGB6、CDH3和CLDN18在TP53Mut和KRASmut腫瘤中表達量最高（圖3D和3E）。TP53Mut和KRASmut腫瘤區域淋巴結轉移率最高（40%），因此TP53、KRAS共突變可能通過整合素-FAK-SRC通路促進iCCA轉移和疾病進展（圖3F）。進一步分析表明，在BAP1Mut和IDH1/2Mut腫瘤中，ECM和膽汁分泌通路是相互激活的，而吞噬體、炎癥和MAPK通路僅在其中一種突變類型的腫瘤中被激活（圖3G和3H）。mRNA和蛋白水平上分析顯示熱點靶藥基因在TP53、KRAS、BAP1和IDH1/2突變群中明顯富集（圖3I）。
圖3 驅動基因突變對蛋白基因組圖譜的影響
4.與FGFR2變異和KRAS突變相關的磷酸化蛋白組學畸變
iCCA中FGFR2信號增強是由突變和染色體易位介導的。作者表明，所有FGFR2突變都位于激酶結構域外（圖4A）。融合基因的FGFR2斷裂點(p.E767)相同，并保留其激酶結構域（圖4B）。每種融合都通過熒光原位雜交進行了驗證（圖4C）。因為FGFR2突變和KRAS突變可能會影響MAPK、PI3K-AKT-mTOR和Rho GTPase通路，作者探索了有和沒有這些變異的腫瘤中顯著改變的磷酸化位點及其相應的蛋白表達，揭示了兩者磷酸位點的異常值（圖4D）。KRAS突變腫瘤表現出明顯的MAPK通路級聯激活，如MAPK14在T180和Y182上均磷酸化，MAP3K2在S514磷酸化，RPS6KA4在S343和T687磷酸化。相反，在FGFR2變異的腫瘤中，MAPK通路輕微下調，而Rho GTPase通路顯著上調（圖4E）。此外，FGFR2變異的腫瘤表現出顯著的PTPN11（Y62）和TLN1（Y70）酪氨酸磷酸化，在蛋白水平上觀察到相似趨勢（圖4F）。熱圖顯示FGFR2和PTPN11蛋白以及PTPN11 Y62磷酸化水平上調，伴隨著FGFR2變異的腫瘤中GRB2表達下調和S90磷酸化。值得注意的是，異常殘基Y62位于N-SH2和PTP結構域之間，此時磷酸化被認為可以穩定活性蛋白的構象（圖4G和4H）。
圖4 FGFR2突變和KRAS突變對蛋白質基因組學圖譜的影響
5.對來自FGFR2::BICC1融合的新表位和相應T細胞應答進行鑒定
對于兩個最常見的FGFR2::BICC1融合蛋白，利用跨越斷點殘基的序列建立了包含所有可能的8-10個氨基酸多肽的序列數據庫（圖5A）。通過四聚體交換實驗，一組肽被成功地交換成HLA-A02:01和HLA-A24:02四聚體（圖5B），然后ELISPOT驗證，CyTOF數據表明T細胞表型隨著多肽刺激發生進化（圖5C）。偽時間分析顯示，T細胞逐漸活化，隨后分叉進入記憶和耗盡2個分支，在成熟后期表現為兩種譜系；同時表達CD45RA（TEMRA）的效應記憶T細胞亞群增加，尤其是效應T細胞（Teff）和pE2，而naive T細胞和中央記憶T細胞減少（圖5D）。因此，受多肽刺激的T細胞有效應表型CD8+ T細胞顯著擴增特征。進一步TCR-seq顯示，在肽刺激后，供體2的TCR發生了顯著轉變。并對TCR克隆型的分布和TCR譜的相似性進行分析（圖5E）。作者證實多肽32刺激供體2后TCR發生重排，并擴增了多個頻率相對低的CDR3s（圖5F）。盡管供體間存在異質性，但低頻率的新表位T細胞反應為iCCA融合患者克服免疫編輯和耐藥性提供了有價值線索。
圖5 鑒定來自FGFR2:BICC1融合的潛在新表位及其對應的T細胞表型
6.具有明顯生物學和臨床特征的蛋白質亞群
用具有多種臨床、基因組、免疫學和微環境特征的1376個蛋白進行聚類分析，作者發現4個不同的蛋白質亞群（S1-S4）（圖6A）。S1中CD14、MPO、C5AR1等炎癥蛋白表達最豐富。S2與癌癥相關的成纖維細胞和ECM相關蛋白水平最高，包括FAP、POSTN和FLT1。S3是MAPK和代謝相關蛋白升高。S4粘附蛋白和膽道特異性蛋白表達最高（圖6B）。臨床上S1多為CA19-9水平升高、腫瘤壞死、肝內轉移的腫瘤。S2有較高的淋巴結轉移。S3以HBV感染患者為主。S4主要富集于CA19-9水平較低、轉移較少的患者。4個蛋白質亞群總生存期差異明顯（圖6C）。每個亞群都有不同的周期性變化的基因（圖6D），并對每個亞群中免疫檢查點、免疫標志物和免疫細胞豐度進行了分析（圖6E）。四個亞群的特異性標志物MPO、POSTN、ALDOB和EPCAM分別代表炎癥（S1）、間充質（S2）、代謝（S3）和分化（S4）（圖6F）。在FU-iCCA人群和驗證人群中，通過多重免疫染色檢測的4個標記物的表達可以對患者生存情況進行分層分析（圖6G）。
圖6 FU-iCCA人群中蛋白質組學分層及相應的分子和通路特征
7.蛋白質組學預后生物標志物的鑒定和驗證
作者進行監督分析來確定預后生物標志物，通過嚴格篩選發現19個預后良好蛋白和15個預后不良的蛋白（圖7A）。其中，HKDC1和SLC16A3分別是FU-iCCA人群中與患者生存呈正相關或負相關的顯著因子（圖7B）。HKDC1和SLC16A3在4個蛋白質亞群中表達差異顯著，S1中SLC16A3表達上調，S4中HKDC1表達上調（圖7C）。通過免疫染色檢測HKDC1低表達和SLC16A3高表達分別與預后差有關（圖7D）。與先前報道不同，HKDC1過表達降低了HuCCT1細胞的增殖、集落形成、葡萄糖消耗和糖酵解能力，支持其在iCCA細胞中的抗糖酵解/增殖作用（圖7E和7G）。正如預期，過表達SLC16A3的HuCCT1細胞表現出增殖快和集落形成能力強（圖7F），這可能是由于更強的糖酵解能力（圖7H）。
圖7 蛋白質組學預后生物標志物的鑒定和驗證
結論：
本研究報道了262個iCCAs大規模蛋白質基因組特征，包括WES、RNA-seq、蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學分析。根據WES數據，黃曲霉毒素特征被確定為主要的突變模式，通過損害基因組穩定性、加速細胞周期和抑制免疫炎癥反應，這可能有助于iCCA的病理發生。iCCA中TP53和KRAS共突變預后極差，轉移增加，可能通過整合素-FAK/SRC通路起作用。FGFR2融合和突變可能通過激活Rho GTPase通路而不是傳統的MAPK通路來促進iCCA。這些發現可能為靶向這些特定的基因改變打開新的治療機會。此外，來自FGFR2:BICC1融合的免疫原性多肽作為早期克隆發生，可能作為免疫原性靶點。發現了四個亞群，為微環境改變提供更好的分層，這可能有助于亞群特異性免疫治療和靶向治療。HKDC1和SLC16A3是具有生物學功能的重要預后指標，盡管這兩個生物標志物都是糖酵解代謝的組成部分，但它們代表了兩種相反的預后方向，并可能指導iCCA患者不同的治療方法。
總之，綜合基因組、轉錄組、蛋白質組、磷酸化蛋白質組和微生物組數據，確定了基因組和轉錄組分析未完全捕獲的潛在分子機制和疾病亞群，這些信息可能會為個性化靶向治療和免疫治療的發展開辟新的途徑，最終使臨床實踐受益。希望本文所描述的結果和分析及相關數據，將為深入研究iCCA的癌變、進展和治療提供豐富的資源。
參考文獻：Dong L, Lu D, Chen R, et al. Proteogenomic characterization identifies clinically relevant subgroups of intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. Cancer Cell. 2022,40(1):70-87.e15.
