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國家自然科學基金委員會生命與醫學板塊于8月發布 “腫瘤免疫與腫瘤代謝”原創探索計劃項目，其中一資助研究方向便在于腫瘤代謝干預新靶點的發現，以更好探索腫瘤代謝與免疫治療之間的關系。今天小編想和大家分享的便是一篇與腫瘤代謝和免疫浸潤高度相關的文章，主要是基于代謝-蛋白質互作（MPIs）構建肝癌MPIs網絡，并進行肝癌分型與代謝和免疫相關機制分析。本篇文章于2021年7月發表在Advanced Science上，影響因子高達16+，綜合全面但又不失細節，看標題“其貌不揚”，有點常規，但是細品很有意思哦。
基于代謝-蛋白質互作網絡構建穩健的肝癌預后相關亞型
Identification and Characterization of Robust Hepatocellular Carcinoma Prognostic Subtypes Based on an Integrative Metabolite-Protein Interaction Network
1.構建MPI網絡
研究者首先從KEGG、Reactome、Human-GEM和BRENDA四個數據庫中提取代謝-蛋白質互作（MPIs）關系(圖1a)。整合四個數據庫中的MPI關系，構建出由1870個代謝物和4132個蛋白(編碼基因表示)組成的定向蛋白質互作網絡(圖1b)。該網絡中包含許多在癌癥中發揮關鍵作用的蛋白質，包括IDH1、PTEN和KRAS等(圖1b)。富集分析結果表明與大多數代謝物相互作用的蛋白(MIPros)參與代謝相關過程，其中一些還與內分泌系統、信號轉導、免疫系統等過程相關(圖1c,d)，表明代謝物可以通過與多種蛋白質相互作用參與細胞過程。
圖1.整合的MPI網絡
2. Pan-Cancer分析識別出HCC特異性的代謝改變
基于主成分分析(PCA)方法對TCGA中包括HCC在內的13種腫瘤中核心MIPros (MPI網絡中有4個以上鄰居的MIPros)的mRNA在腫瘤組織和正常組織中的表達進行分析。主成分分析表明HCC顯示出最獨特的代謝模式(遠離其他癌癥類型，圖2a)。另外，與其他12種癌型相比，HCC中的MIPros可以更多的富集到在癌癥-正常樣本中發生差異表達的基因與癌癥預后相關基因中(圖2b,c)。此外，通過基因集富集分析(GSEA)評估每種癌癥類型中腫瘤和正常組織之間的通路水平改變(圖2d)，分析結果表明HCC在13種癌癥類型中表現出最顯著的代謝改變(當聚類數K = 3時，HCC被聚為一個孤立的類，圖2d)。與癌旁組織相比，HCC腫瘤組織中出現大量代謝通路下調，該結果可以在四套獨立的HCC數據中被觀察到，包括TCGA，LIRI-JP和兩套來自于GEO的數據集 (圖2d)。
圖2.13種癌癥類型中腫瘤和正常組織間的代謝變化
3. 基于MIPro表達譜識別在預后和缺氧方面存在差異的HCC亞型
以上分析表明，HCC與其他癌癥類型相比具有明顯的代謝特征。同時，HCC內部也存在高度代謝異質性。為體現代謝異質性，研究者基于PCA分析對核心MIPro進行降維，并基于一致性聚類方法將HCC聚類為兩個亞型。其中C1亞型的預后明顯比C2差(圖3a,b)。對其他癌癥類型也進行同樣的分析，KIRC和UCEC的不同亞型間也存在預后差異，而HCC的預后差異最顯著(圖3c)。
為探究兩種HCC亞型間的分子差異，研究者進一步識別在某種亞型中特定富集的體細胞突變。其中，C1亞型富集到更多的TP53、BAP1等已知抑癌基因突變，而C2則富集到更多的CTNNB1等基因突變(圖3d)。同時，研究者還基于隨機森林算法識別出在HCC亞型劃分過程中發揮作用最大的基因，并將其定義為亞型特異基因(圖3d)。研究者利用排名前30的的亞型特異基因，通過lasso回歸模型進一步構建分類器，并將此亞型分類器應用于其他獨立的HCC數據，不同數據中可以觀察到兩種亞型間具有一致的表達改變(圖3e)和臨床預后差異(圖3f)。
此外，研究者還識別出與子類型相關的PPI網絡模塊(圖3g)。其中C1亞型中CAT中心模塊下調。該模塊成員主要為過氧化物酶體(圖3g)，其相互作用的代謝物在多個代謝途徑中富集，特別是脂肪酸相關途徑。過氧化物酶體與脂質代謝密切相關，因為它們能夠進行脂肪酸氧化和脂質合成。C1中過氧化物酶體的下調表明其脂肪酸氧化和脂質合成過程受到抑制。
研究者還對兩種亞型在蛋白質組水平的差異進行分析(圖3e)。在C1中上調的蛋白主要參與HIF-1、PI3K/AKT和胰島素信號等生物學過程。HIF-1信號通路上調提示缺氧狀態。相應地，C1亞型的缺氧評分明顯高于C2(圖3h)。在C1中，趨化因子信號通路等多個免疫相關通路也發生上調。
此外，兩種HCC亞型在體重，年齡等方面也存在顯著差異 ，在TMB 和HBV/HCV感染或肝纖維化嚴重程度上不存在顯著差異(圖3h)。
圖3.HCC亞型的識別
4. 不良預后亞型與代謝通路的DNA甲基化、免疫通路的上調和脂肪酸積累有關
在四套HCC數據中都可以觀察到，與C2相比，預后不良亞型C1中的代謝通路發生較大范圍下調和多個免疫通路的上調 (圖4a)。DNA甲基化與基因表達沉默有關。研究者對兩種亞型之間的DNA甲基化進行比較，最終發現與C2相比，C1的多個mRNA都發生超甲基化，表明C1代謝通路的下調可能是代謝酶的超甲基化所致。免疫和代謝之間呈現負相關關系（圖4 b, c），且C1亞型表現出更高的免疫相關分數（ImmuP，圖4d）。這些免疫通路的上調不能簡單的從DNA甲基化水平改變的角度來解釋，表明代謝改變和免疫調節之間一定有其他機制的聯系。
此外，研究者還利用定向MPI網絡來估計不同亞型中代謝物的變化。以亞油酸為例，研究者提取亞油酸的定向MPI子圖，并根據C1和C2亞型之間連接蛋白的表達差異來評估C1亞型相對亞油酸的積累。由于能消耗亞油酸的MIPros (CYP2A13、CYP2B6、CYP1A1等)在C1中明顯下調，而催化亞油酸生成的MIPros (CEL、ACOT7、ACOT4等)要么上調，要么輕微下調，因此研究者推斷C1亞型的樣本比C2更有可能積累亞油酸。同樣，脂肪酸代謝和不飽和脂肪酸生物合成途徑的代謝物，如花生四烯酸和亞油酸，更有可能在C1中積累，而碳代謝的代謝物，丙酮酸代謝等更有可能被消耗(圖4e，f)。為驗證結果，研究者使用一套同時檢測轉錄組學和代謝組學的HCC數據集，首先利用轉錄組學數據劃分C1和C2亞型，并基于代謝組學檢測兩亞型之間的代謝物是否存在顯著差異，實驗結果和上述估計一致(圖4e，f)。
不飽和脂肪酸已被發現可促進HCC的增殖和進展，這一結果與不飽和脂肪酸在預后不良亞型中的積累一致。鑒于C1亞型中細胞周期通路顯著上調 (圖4a)，研究者推測C1缺氧亞型中癌細胞的快速增長可能取決于代謝產物的積累，尤其是不飽和脂肪酸,而不是糖酵解生成的代謝產物。此外，研究者還假設積累的代謝物(圖4f)可能在上調HCC免疫通路中發揮一定作用。
圖4.代謝和免疫調節之間的相互作用
5.基于MPI預測模型識別潛在的連接代謝和免疫調節的MPI
為驗證C1中積累的代謝物可能通過與相關蛋白相互作用而誘導免疫通路上調的假設，研究者開發出一個MPI預測模型，以幫助識別鏈接代謝通路與免疫系統之間的關鍵MPI。該預測模型利用6個基于網絡的關聯特征來描述代謝產物和蛋白質之間的相互作用(圖5a)，結果表明存在互作關系的代謝物和蛋白質之間的關聯性明顯高于隨機配對(圖5a)。因此，研究者開發出一個基于隨機森林的MPI預測模型(圖5b)，該模型的AUC值可以達到0.97，具有較高精確性，MPI和隨機代謝-蛋白對大多可以通過預測概率分離(圖5c)。
基于該MPI預測模型，研究者發現一些置信度較高的的MPIs (圖5d)，除已知的有限代謝相互作用外(圖5e)，研究者還發現多個參與免疫系統并在C1中上調的蛋白與各個方面的代謝物存在相互作用，尤其是碳水化合物和脂質代謝(圖5d)。例如，CTLA4，一個著名的免疫檢查點，可以阻止T細胞攻擊其他細胞，被預測為會與參與不飽和脂肪酸生物合成和肌醇磷酸鹽代謝的代謝物相互作用。PDCD1(又稱PD1)可以與精氨酸生物合成或脂肪酸降解等代謝物相互作用等。此外，不飽和脂肪酸的生物合成也與這些免疫調節因子有較高的相關性(圖5d)。研究發現，SRC、CTLA4、IKBKE和TGFB1(上皮-間質轉化的關鍵誘導物，也參與免疫功能)與各種脂肪酸和輔酶a (CoAs)存在相互作用(圖5f)。
圖5.潛在連接代謝和免疫調節MPI的預測
6.亞型間免疫微環境的差異
研究者基于xCell工具，根據組織樣本的RNAseq數據，預測64種不同類型細胞在TME中的富集程度，估算HCC樣本的TME組成。并對C1和C2亞型患者間的TME進行比較（圖6a）。結果表明C1亞型可能有更多的免疫細胞浸潤，同時PDCD1、CTLA4等多個T細胞耗竭標志物在C1中表達顯著升高(圖6b)，說明C1亞型中浸潤的T細胞主要為耗竭T細胞。C1亞型的整體間質評分低于C2，而C1的免疫評分和腫瘤純度則更高(圖6c)。
研究者還進一步整合單細胞數據，以評估免疫細胞是否也顯示出類似的代謝模式。研究者基于細胞數據集(GSE98638)將HCC T細胞分類為C1和C2亞型樣細胞。研究者發現C1亞型類似CD8+ T細胞的PDCD1表達顯著升高，過氧化物酶體CAT的表達顯著降低(圖6d)，進一步從單個細胞的角度證實免疫反應與CAT相關代謝調節之間的聯系。此外，研究者還基于CCLE中HCC細胞系的表達數據，劃分C1/C2亞型樣肝癌細胞系，并檢測不同藥物在兩種亞型之間產生的不同治療效果，與C2樣HCC細胞株相比，C1樣HCC細胞株對SRC抑制劑saracatinib更敏感(圖6e)。
由于C1亞型樣品的TME組成波動較大(圖6a)，根據TME分布圖，研究者將C1亞型進一步劃分為S1和S2兩個亞種群。有趣的是，S1的預后最差，C2的預后最好，S2處于中間狀態(圖6f)。同時，通路分析顯示，與S2相比，S1各個代謝通路的mRNA水平均發生下調。三種亞型在缺氧及多種免疫相關蛋白(SRC、MMP1、IL12A等，圖6g、h)中均逐漸顯著降低，為S1亞型提供潛在的治療靶點。同時，S1亞型也比S2亞型更容易積累不飽和脂肪酸(圖6i)。并將這三種重新定義的亞型與另外兩種HCC亞型定義方法進行比較，發現本方法劃分的亞型間存在最顯著的生存差異 (圖6f)。
圖6.HCC各亞型的TME特征
7. HCC中兩種主要HCC亞型的代謝和免疫特征驗證
考慮到C1亞型缺氧分數顯著高于C2，研究者分別在缺氧和常氧條件下利用SNU449細胞系培養模擬C1和C2亞型，并基于轉錄組和代謝組學對兩個肝癌亞型的特性進行驗證(圖7)。轉錄組學分析表明，缺氧組多個免疫系統通路上調，多個代謝通路發生下調(圖7b)， ALDH1B1、GCDH、LIPG等多種代謝酶明顯下調(圖7c)。同時，在HepG2細胞中，預計SRC與某些不飽和脂肪酸相互作用，對C1亞型的免疫調節起關鍵作用(圖5f)，其表達水平也隨著缺氧處理顯著升高(圖7d)。
從代謝組學的角度來看，缺氧SNU449細胞的多個脂肪酸水平較高(圖7 e-f)。這些結果證實C1亞型肝癌預后不良與多種代謝途徑的酶下調、脂肪酸積累以及多種免疫調節因子上調密切相關。
圖7. HCC亞型特征的驗證
今天的文章緊貼國自然熱點資助方向，對HCC代謝-蛋白之間的互作進行充分分析，并基于代謝-蛋白互作網絡中的核心蛋白構建亞型分類器，結合單細胞分析，細胞系分析以及實驗分析等多種分析方法，對HCC代謝產物與TME之間關聯等代謝與免疫之間的關系進行探究，是一篇非常全面綜合，但又充滿細節的文章，還在發愁“腫瘤免疫與腫瘤代謝”怎么做的同學一定要認真學習下哦！
