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癌癥相關成纖維細胞(CAF)一直以來都備受關注，今天小編要給大家分享的是一篇發表在Oncoimmunology（IF:8.11）上題為Landscape of cancer-associated fibroblasts identifies the secreted biglycan as a protumor and immunosuppressive factor in triple-negative breast cancer[1]的文章。就讓我們一起來學習這篇文章的研究思路吧~
背景介紹
1.三陰性乳腺癌 (TNBC)
三陰性乳腺癌 (TNBC) 是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體 2 (HER2)均為陰性的一種特殊分子亞型的乳腺癌，約占全部乳腺癌的五分之一，是乳腺癌中預后相對較差的一類。
2.腫瘤微環境 (TME)[2]
腫瘤微環境 (TME) 是指腫瘤周圍的直接生態位，由代謝環境中的各種類型的細胞組成。血管提供氧氣和營養，并負責清除廢物；其中的細胞主要包括基質細胞和免疫細胞，基質細胞和免疫細胞通過分泌信號分子和細胞外基質(ECM)成分來調節腫瘤生長。癌細胞的高代謝活性、血流功能失調和炎癥增加，導致TME具有生理特性失調的特點。更詳細的TME介紹請看Nature metabolism: 腫瘤微環境中的代謝和免疫。
3.癌癥相關成纖維細胞 (CAF)[3]
癌癥相關成纖維細胞 (CAF)主要是由組織中固有成纖維細胞或星狀細胞在生長因子的刺激下轉變而來，此外，腫瘤組織中的上皮細胞、內皮細胞、骨髓間充質干細胞（MSC）等細胞也可分化為CAFs。腫瘤組織中的CAFs具有異質性，不同亞型CAFs表面標志物表達情況不同。
CAFs 通過分泌各種細胞因子與其他基質細胞、腫瘤細胞進行信息交流，抑制免疫細胞功能，促進腫瘤發展；也可調控胞外基質，對藥物與免疫細胞的浸潤產生屏障作用。關注CAFs在腫瘤微環境中的功能和機制可能為乳腺癌治療，特別是免疫治療提供一種策略。想要了解更多的CAF研究思路，請移步火爆全網的癌癥相關成纖維細胞(CAF)最全面總結。
4.METABRIC數據庫[4]
METABRIC（乳腺癌國際聯盟的分子分類學）是一項加拿大與英國合作項目，旨在根據有助于確定最佳治療過程的分子特征將乳腺腫瘤分類為更多的亞類。這項研究涉及2000名乳腺癌患者的大型研究，揭示出乳腺癌能夠被劃分為10種亞型。可通過cBioportal（http://www.cbioportal.org/index.do）下載其中的數據。
數據來源
TCGA數據庫中的的TNBC隊列（含116名患者）、METABRIC-TNBC隊列、GEO數據庫中的GSE25066、GSE103091、GSE21653和GSE88715數據集以及scRNA-seq數據集（GSE114727、GSE136206、GSE138536等）。
分析思路
（上述流程圖主要列舉了文中用到的生信分析方法，除此之外本文還有相關實驗驗證）
結果
1. 基于CAF標記對TNBC隊列分型
本文作者首先通過查閱文獻收集了研究中報道的典型的CAF markers（包括ACTA2、FAP、PDGFRA、PDGFRB、PDPN、THY1 和 COL1A1的等），利用這些markers的表達情況對樣本進行聚類，將樣本分為markers高表達、中表達及低表達的三個亞型，并通過PCA來驗證聚類分群的效果。見圖1。
為了進一步分析上述不同亞型樣本的成纖維細胞和免疫特征，作者分別在METABRIC-TNBC、TCGA-TNBC和GSE25066-TNBC隊列中比較了不同浸潤組中MCP-counter 和 xCell 的成纖維細胞評分，發現從低浸潤組到高浸潤組有明顯的上升趨勢。此外，作者還比較了iCAF 和 myCAF 標志物的表達，結果表明高、中浸潤組樣本中有大量CAF標志物明顯上調，這說明這些組中的樣本有大量浸潤的CAF。見圖2。
2. CAFs浸潤與免疫特征的相關性
我們已知CAF在腫瘤微環境的免疫調節中具有關鍵作用，于是作者進一步研究了CAF與免疫之間的相關性。他們首先計算了METABRIC-TNBC、TCGA-TNBC 和 GSE25066-TNBC 隊列中不同浸潤組（高與低、中與低）之間基因的表達變化，篩選出免疫相關基因（圖2c、f和i）。其次，作者在高浸潤組和低浸潤組中進行了GSVA分析，比較了兩組樣本之間的癌癥標志性信號通路，發現部分免疫相關信號通路在高浸潤組中顯著富集（圖3a-c）。接下來，作者還評估了CAF與免疫細胞之間的相關性，發現CAF與CD8+T細胞和活化的NK細胞呈負相關，同時可能與M2巨噬細胞有正相關性（圖3d-f）。
3. BGN上調并主要在CAF基質中表達
為進一步研究與CAF相關的標志物及其相應的預后價值，作者利用RNA測序和質譜進一步研究分析NAF(正常癌癥相鄰成纖維細胞)和CAF組之間的差異表達基因。與NAF相比，BGN(Biglycan)在CAF中顯著上調，且已有研究表明BGN在治療的抵抗性和免疫活性中發揮作用。在這里，作者不但在TCGA-TNBC隊列中也觀察到了腫瘤組織中BGN顯著上調，還利用Western實驗進行了驗證。見圖4。
接下來，作者利用TNBC scRNA-seq數據在單細胞層面分析了BGN的表達情況（圖5），發現BGN主要在TNBC中的成纖維細胞群中表達。同時又在另一個單細胞數據集中發現BGN主要在CAF和血管周圍樣（PVL）細胞群中表達。而且BGN的表達水平與成纖維細胞和內皮細胞有顯著的相關性（圖6）。這些結果進一步表明，BGN可能是TNBC中CAF特異性的生物標志物，并在細胞外基質中發揮其功能。
4. biglycan相關生物學和臨床特征
BGN 基因編碼的雙糖鏈蛋白聚糖（biglycan），是一種細胞外可溶性蛋白質，可能通過細胞間接觸發揮其功能。作者先是用BGN相關基因進行GO富集分析，結果發現參與癌癥進展和TME調節的代表性信號通路在METABRIC-TNBC、TCGA-TNBC、GSE25066-TNBC隊列中顯著富集。于是作者進一步分析了BGN與免疫特征之間的相關性。首先是分析BGN與免疫相關基因之間的相關性，發現BGN可能影響免疫細胞浸潤或調節免疫活性。于是作者又計算了BGN表達水平與STIMATE 分數之間的相關性，以及BGN與免疫成分之間的相關性。見圖7。
在文章最后，作者將BGN與臨床進行了關聯分析。首先在表達水平上，TNBC樣本中的BGN表達水平明顯低于非TNBC樣本。其次，通過Kaplan-Meier 分析發現， BGN表達水平較高的患者的生存情況更差。免疫組化分析也發現高biglycan表達的患者樣本總體CD8+T細胞的浸潤水平更低。生存分析表明，biglycan可能作為 TNBC 的不良預后標志物。見圖8。
小結
目前而言，在三陰性乳腺癌中CAF與腫瘤細胞和免疫細胞之間的相互作用的研究還很少。本文作者通過結合普通轉錄組和單細胞轉錄組的數據研究了CAF 在TNBC中的作用及其功能的潛在新介質，最后確定了一種細胞外蛋白biglycan，作為TNBC的預后標志物和潛在治療靶點。這篇文章可以說是公共數據挖掘加實驗驗證的一個典型套路了。
思路拓展
TME作為腫瘤賴以生存的基礎，為腫瘤的增殖、轉移、侵襲提供物質基礎。TME非常復雜，其與腫瘤代謝和腫瘤免疫系統的相互作用十分密切。CAFs 對腫瘤發展有著重要的促進作用，因此，靶向調控 CAFs的腫瘤治療策略有望抑制腫瘤進展。將這兩者相結合用以對腫瘤靶向藥的研究分析或將取得重大突破。
在數據分析方面，本文所用的數據主要是來自于公共數據，可見數據挖掘還是很重要的。但僅僅只有數據挖掘的能力還是不夠的，得學會最大化利用公共數據，將不同類型的數據巧妙的結合起來。就像這項研究中，作者通過結合常規轉錄組和單細胞轉錄的數據來分析CAFs，既描述了基于CAF的不同樣本分析，還描述了TNBC中CAF相關的marker基因在不同細胞的表達情況。不難發現，目前常規轉錄組和單細胞的結合是一個非常火的分析手段。
參考文獻
